La matriz extracelular en la curación de las heridas cutáneas. Aspectos físicos, químicos y biológicos / Extracellular matrix in healing of cutaneous wounds. Physical, chemical and biological aspects

Se revisan los nuevos conocimientos sobre la matriz extracelular (MEC), que han permitido descubrir su importante rol en la cicatrización de las heridas cutáneas. Se describen sus características morfofisiológicas y cómo interviene en la curación de las heridas cutáneas. Se presentan cuatro casos clínicos en los que se aplicó este enfoque terapéutico: los sustitutos de piel y la “cura húmeda”.

We review the new knowledge about the extracellular matrix (ECM) that has allowed us to discover its important role in the healing of cutaneous wounds. The morphophysiological characteristics of ECM and its role in the healing of cutaneous wounds are described. Four clinical cases are presented where this therapeutic approach was applied: the skin substitutes and the “moist wound healing”.

Evaluation of electrospun PLLA-ECM scaffolds as biomaterials for bone regeneration / Avaliação de suportes eletrofiados de PLLA-ECM para regeneração óssea

The extracellular matrix (ECM) is secreted by the host tissue and is an important key for mechanisms of cell responses. The main properties of the ECM materials include biodegradability, biocompatibility, and nanostructured in a 3D fibre network. In addition, ECM is composed of important molecules like growth factors, glycosaminoglycans (GAGs), collagens, fibronectin, and lamin, while final composition depends on the native tissue. We have selected for this study ECMs from cortical bone (B-ECM) and pericardium (P-ECM) tissue. These ECMs were digested by collagenase, pepsin and trypsin. Each of these digested ECMs was used to produce PLLA-ECM based electrospun scaffolds by two different methodologies (1) non-crosslinked (NCLK) hybrid electrospun scaffolds composed of PLLA and digested ECMs and (2) PLLA-collagen electrospun scaffolds crosslinked with digested ECMs (CLK scaffolds). This research proposes the characterization of the digestion promoted by collagenase, pepsin and trypsin on the ECMs, followed by the evaluation of the potential of the digested ECMs and of the PLLA-ECM scaffolds for bone regeneration. The proteinaceous mixture, produced from the ECM digestion, had compositions, which were dependent on the type of ECM, and on the enzymatic treatment, as shown by protein quantification, GAGs quantification, TGA, SDS-page and TPEF-SHG. All the results point to an extensive digestion caused by collagenase and pepsin and a milder digestion caused by trypsin. The digested ECMs were incorporated into nanofibrous scaffolds, and the products were characterized by SEM, TGA, DSC and TPEF-SHG. The porous nanofibrous mesh from non-crosslinked scaffolds exhibited fibres without beads and a uniform diameter. However, the crosslinked scaffolds presented non-organized agglomerates around the fibres making a less porous surface. TGA and DSC suggest the incorporation of the ECMs on the scaffolds. However, the distribution of the protein on the polymer was mostly dependent on the incorporation method, as showed by TPEF-SHG. To access the biomaterial ability for bone regeneration, bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) were cultured on the scaffolds over 21 days. Osteogenic markers such as ALP activity, mineral nodule formation by ARS staining, col1a2 immunostaining, and gene expression were analysed to access how the materials could induce BMMSCs osteodifferentiation. Comparing NCLK to CLK scaffolds the key factor for osteogenesis is the release of soluble factors, showing NCLK scaffolds with a higher ability to induce mineralization than CLK scaffolds. However, when comparing the effect of the enzymatic digestion on the mineralization of the scaffolds over the days, it is possible to establish that the effect of the enzymatic treatment is also related to the type of ECM. Despite all those differences, some PLLA-ECM scaffolds exhibited potential to induce earlier mineralization, observed by the analysis of bglap, runX2, Osx, sparc and col1a2 genes as osteogenic markers

A matriz extracelular (ECM) é secretada pela células no tecido nativo e reúne propriedades chave para respostas celulares. Entre suas principais propriedades destacam-se: biodegradabilidade, biocompatibilidade e nanoestruturada tridimensionalmente. Além disso, é rica em sinalizadores celulares tais como: fatores de crescimento, glicosaminaglicanas (GAGs), colágeno, fibronectina e laminina, no entanto sua composição depende do tecido na qual se encontra. Para este estudo, foram selecionadas ECMs provenientes de osso cortical e de pericárdio. Estas ECMs foram digeridas por colagenase, pepsina e tripsina. Cada um dos produtos de digestão foi utlizado para a produção de suportes eletrofiados de PLLA-ECM, utilizando-se dois diferentes métodos de incorporação, (1) Suportes eletrofiados híbridos de PLLA-ECM obtidos a partir da eletrofiação da co-solução em 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol, e (2) imobilização das ECM digeridas sobre suportes eletrofiados de PLLA-colágeno. O presente trabalho propõe-se a caracterizar as ECMs digeridas e a avaliar o potencial dos suportes eletrofiados de PLLA-ECM para a regeneração óssea. A mistura proteinácea obtida a partir da digestão das ECMs, mostrou que a sua composição é dependentes do tipo de ECM e da digestão enzimática, resultado este confirmado através da quantificação de proteínas, quantificação de glicosaminoglicanas, TGA, SDS-page e TPEF-SHG. A partir destes, foi observada que a colagenase é a enzima que promove a maior degradação das ECMs, enquanto que a tripsina promove uma degradação em menor escala. As matrizes digeridas foram incorporadas no material nanoestruturado, estes foram caraterizados por SEM, TGA, DSC e TPEF-SHG. Observou-se que a malha eletrofiada a partir da co-solução de PLLA-ECM exibiu a formação de fibras de diâmetro uniforme, enquanto que os suportes imobilizados apresentaram a formação de aglomerados sólidos ao redor das fibras, originando uma malha menos porosa. As análises de TGA e DSC confirmaram a incoporação das ECMs nas malhas eletrofiadas, e através da técnica de TPEF-SHG observou-se a distribuição das proteinas no polímero. O potencial dos materiais para a regeneração óssea foi avaliado através da cultura de células tronco mesenquimais de medula óssea sobre os suportes eletrofiados durante 21 dias, e em seguida, medidas de ALP, quantificação de coloração com vermelho de alizarina, imunofluorescência com anticorpo col1a2, e expressão de gênica foram analisadas para a avaliação de como os materiais eletrofiados de PLLA-ECM induzem a osteodiferenciação. Comparando-se materiais produzidos por co-solução e os materiais imobilizados foi possível observar que a resposta osteogênica é maior nos materiais híbridos devido a liberação de fatores solúveis dos suportes eletrofiados. No entanto, comparando-se o efeito da digestão enzimática na capacidade de mineralização dos suportes , é possível observar que o efeito da digestão enzimática é dependente do tipo de ECM. Em geral, foi possível observar que os suportes eletrofiados de PLLA-ECM exibem potencial para uso em engenharia de tecidos, em específico, regeneração óssea, uma vez que apresentaram-se regulados o conjunto de genes bglap, RunX2, Osx, sparc e col1a2

Análise do efeito de substâncias liberadas por adesivos dentinários sobre a atividade e a expressão gênica de proteases da matriz extracelular (MMPs e CTs) em células-tronco da polpa dentária humana / Analysis of the effects of substances leached from adhesive systems on the activity and gene expression of extracellular matrix proteases (MMPs e CTs) in human dental pulp stem cells

Adesivos dentinários aplicados diretamente sobre dentina aumentam a atividade de enzimas endógenas deste tecido que degradam colágeno, colocando em risco a integridade da camada híbrida de restaurações estéticas. Estes adesivos podem também alcançar a polpa dentária indiretamente através do fluído dos túbulos dentinários por substâncias liberadas pelos mesmos. Desta forma, a polpa dentária poderia responder a estas substâncias por meio de síntese e/ou aumento da atividade de colagenases, o que poderia colaborar na degradação da camada híbrida. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito das substâncias liberadas por sistemas adesivos dos tipos autocondicionante e condicione e lave sobre a atividade e a expressão gênica de metaloproteinases (MMPs) e cisteíno-catepsinas (CTs) em células-tronco da polpa dentária humana. Foram aplicados meios de cultura condicionados por adesivos do tipo autocondicionante e condicione e lave polimerizados e não polimerizados sobre culturas celulares por 24 horas. O meio de cultivo fresco foi usado como controle. Depois de 24, 48, 72 e 96 horas, as atividades gelatinolíticas de MMP-2 e de MMP-9 foram avaliadas por meio da técnica de zimografia em gel de gelatina. Nos mesmos tempos experimentais, a modulação da expressão gênica das MMPs (1, 2, 3, 7, 9, 13 e 14) e das CTs (B e K) foi analisada por meio de reação de transcriptase reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Os resultados obtidos dos dois experimentos foram avaliados por meio do teste estatístico ANOVA, complementado pelo teste de Tukey (p<0.05)...

Adhesive systems directly applied to dentin increase the activity of endogenous collagen degrading proteinases of the dentin, which jeopardizes the integrity of the hybrid layer of aesthetic restorations. These adhesives can also reach the dental pulp through the dentinal fluid indirectly by substances leached from them. Then, the dental pulp tissue could respond by synthetizing and/or increasing the activity of collagen proteases, which in turn could collaborate to the hybrid layer degradation. Then, the aim of this study was to evaluate the effect of substances leached from self-etch and etch-and-rinse adhesive systems on the expression and activities of matrix metalloproteinases (MMPs) and cysteine cathepsins (CT-B and CT-K) in human dental pulp stem cells. Culture media conditioned by polymerized or non-polymerized self-etch and etch-and-rinse adhesive systems were applied to the cultures for 24 hours. Fresh medium was used as control. After 24, 48, 72 and 96 hours, the gelatinolytic activities of MMP-2 and MMP-9 were assessed by zymography technique. At the same experimental time gene expression of MMPs (1, 2, 3, 7, 9, 13 e 14) and CTs (B e K) were analyzed with quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Data was compared by ANOVA complemented by the Tukey´s test (p<0.05). All experimental groups showed increased gelatinolytic activity for MMP-2 and MMP-9. Until 72 hours, the activities were similar regardless the group...

Genes responsible for vaginal extracellular matrix metabolism are modulated by women's reproductive cycle and menopause

Objectives To analyze the expression of genes involved in extracellular matrix (ECM) biogenesis and remodeling in vaginal tissue of women with clinically normal pelvic floor support (defined as controls) according to the phase of menstrual cycle and postmenopausal women with and without pelvic organ prolapse (POP). Materials and Methods This study examined the expression of matrix metalloproteinases (MMPs), their tissue inhibitors (TIMPs), and the Lysyl oxidase (LOX) family genes in the anterior vaginal wall of Caucasian women by real-time RT-PCR. Initially, mRNA expression was assessed in premenopausal controls in the secretory (group 1, n = 10) vs. proliferative (group 2, n = 8) phase of menstrual cycle. In addition, we compared premenopausal controls in the proliferative phase (group 2) vs. postmenopausal controls (group 3, n = 5). Finally, we analyzed postmenopausal controls (group 3) vs. postmenopausal women with advanced POP (group 4, n = 13). Results According to the phase of menstrual cycle, MMP1 was significantly reduced (p = 0.003), whereas the expression of TIMP1 and LOXL4 was significantly up-regulated during proliferative phase (both p < 0.01) when compared to the secretory phase in premenopausal control women. Regarding menopausal status/ageing, all MMPs were down-regulated, while TIMP3, TIMP4 and LOXL2 were significantly up-regulated in postmenopausal control women when compared to premenopausal controls (p = 0.005, p = 0.01 and p < 0.001, correspondingly). TIMP4 and LOXL2 mRNA levels were significantly decreased in postmenopausal POP patients compared to asymptomatic postmenopausal controls (p < 0.01 for both). Conclusions Our results indicate that ovarian cycle and age-related changes influence the expression of genes encoding proteins responsible for ECM metabolism in human vagina. Moreover, POP is associated with alteration in vaginal ECM components after menopause. .

Upregulation of matrix synthesis in chondrocyte-seeded agarose following sustained bi-axial cyclic loading

OBJECTIVES: The promotion of extracellular matrix synthesis by chondrocytes is a requisite part of an effective cartilage tissue engineering strategy. The aim of this in vitro study was to determine the effect of bi-axial cyclic mechanical loading on cell proliferation and the synthesis of glycosaminoglycans by chondrocytes in threedimensional cultures. METHOD: A strain comprising 10% direct compression and 1% compressive shear was applied to bovine chondrocytes seeded in an agarose gel during two 12-hour conditioning periods separated by a 12-hour resting period. RESULTS: The bi-axial-loaded chondrocytes demonstrated a significant increase in glycosaminoglycan synthesis compared with samples exposed to uni-axial or no loading over the same period (p<0.05). The use of a free-swelling recovery period prior to the loading regime resulted in additional glycosaminoglycan production and a significant increase in DNA content (p<0.05), indicating cell proliferation. CONCLUSIONS: These results demonstrate that the use of a bi-axial loading regime results in increased matrix production compared with uni-axial loading.

Efeitos de EGF e do TGF-β sobre o desenvolvimento e sobre os componentes da matriz extracelular do germe dental in vitro / Effects of the EGF and the TGF-β on the development and components of the extra-cellular matrix of tooth germs in vitro

Germes dentais de molares de fetos de camundongos de 14 ou de 17 dias foram cultivados na presença de EGF ou de TGF-β com a finalidade de estudar os efeitos desses fatores de crescimento sobre o desenvolvimento do germe e sobre os componentes da matriz extra celular do tecido conjuntivo. Após o período de observação os germes foram incluídos em parafina, cortados e corados com hematoxilina e o eosina ou congelados em nitrogênio líquido, cortados e submetidos a reação imunocitoquímica para laminina, fibronectina ou colágeno tipo I. Os resultados mostraram uma série de efeitos que permitiram chegar às seguintes conclusões. 1. houve estimulação da proliferação celular, atraso no desenvolvimento do germe dental e inibição da diferenciação celular sob ação do EGF e mais acentuadamente sob o TGF-β. 2. O EGF e o TGF-β não interferiram na presença e distribuição dos componentes da matriz do conjuntivo estudados. 3. A laminina foi identificada nas interfaces epitélio-ectomesênquima do órgão do esmalte com a papila e com o folículo dentais e da gengiva e em formações vasculares na papila no folículo dentais. 4. A fibronectina foi identificada na papila e no folículo dentais principalmente nos germes dentais de fetos mais idosos e entre o epitélio interno do órgão do esmalte e a papila dental. 5. O colágeno tipo I foi identificado entre o epitélio do órgão do esmalte e o ectomesênquima da papila e o do folículo dentais e em regiões específicas dessas estruturas.