PCR-RFLP Based genetic diversity of Plasmodium vivax genotypes in district Mardan, Pakistan / Diversidade genética baseada em PCR RFLP de genótipos de Plasmodium vivax no distrito de Mardan, Paquistão

Plasmodium vivax is the most common human malaria parasite in Asian countries including Pakistan. Present study was designed to explore the genetic diversity of plasmodium vivax genotypes based on Pvmsp-3α and Pvmsp-3βgenes using allelic specific nested PCR and RFLP assays markers from field isolates in district Mardan, Pakistan. Blood samples of 200 P. vivax malarial patients were collected after taking their written informed consent. Genetic diversity in nested PCR products was determined by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizing Alu1 and PstI restriction enzymes for alpha and beta gene products digestion, respectively. For analysis the genetic diversity of the sub allelic variants of Pvmsp3α and Pvmsp3β genes, Chi-Square test was performed by utilizing Minitab programming software 18. The P value 0.05 was considered as statistically significant. For Pvmsp 3α genes after gel electrophoresis of digested products, four distinct genotypes were obtained from total of 50 samples; type A: 35 (70%) (1.5-2.0 kb), 12 of type B (24%) (1.5-1.7 kb), 2 of type C (4%) (0.5-1.5) and one for type D (2%) (0.5-0.65 kb) which could be characterized into 9 allelic pattern (A1-A4, B1-B3, C1, D), in which A3 remained the most predominant. For Pvmsp-3βgenes, three distinct genotypes were obtained from 50 samples; 40(80%) of type A (1.5-2.5 kb), 9 (18%) of type B (1.0-1.5kb) and 1(2%) of type C (0.65 kb) which could be characterized into 6 allelic patterns (A1-A3, B1-B2, and C1). Most dominant one in Type A was A1 alleles which were noted (46%), while in Type B, the most dominant were B1 (10%).This study is the first ever report of molecular epidemiology and genetic variation in Pvmsp-3α and Pvmsp-3β genes of P. vivax isolates by using PCR/RFLP from District Mardan and [...].

O Plasmodium vivax é o parasita da malária humana mais comum nos países asiáticos, incluindo o Paquistão. O presente estudo foi desenhado para explorar a diversidade genética de genótipos de Plasmodium vivax baseados nos genes Pvmsp-3α e Pvmsp-3β, usando marcadores de ensaios alélicos nested PCR e RFLP de isolados de campo no distrito de Mardan, Paquistão. Amostras de sangue de 200 pacientes com malária por P. vivax foram coletadas após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. A diversidade genética em produtos de PCR nested foi determinada por polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) utilizando as enzimas de restrição Alu1 e PstI para a digestão dos produtos dos genes alfa e beta, respectivamente. Para análise da diversidade genética das variantes subalélicas dos genes Pvmsp3α e Pvmsp3β, o teste Qui-quadrado foi realizado utilizando o software de programação Minitab 18. O valor P = 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para os genes Pvmsp 3α, após eletroforese em gel de produtos digeridos, quatro genótipos distintos foram obtidos de um total de 50 amostras; tipo A: 35 (70%) (1,5-2,0 kb), 12 do tipo B (24%) (1,5-1,7 kb), 2 do tipo C (4%) (0,5-1,5) e um para o tipo D (2%) (0,5-0,65 kb), que podem ser caracterizados em nove padrões alélicos (A1-A4, B1-B3, C1, D), em que A3 permaneceu como o mais predominante. Para Pvmsp-3βgenes, três genótipos distintos foram obtidos a partir de 50 amostras; 40 (80%) do tipo A (1,5-2,5 kb), 9 (18%) do tipo B (1,0-1,5 kb) e 1 (2%) do tipo C (0,65 kb), que podem ser caracterizados em seis padrões alélicos (A1-A3, B1-B2 e C1). Os mais dominantes no tipo A foram o alelo A1, observados em 46%, enquanto, no tipo B, os mais dominantes foram B1 (10%). Este estudo é o primeiro relato de epidemiologia molecular e variação genética em Pvmsp-3α. Os genes Pvmsp-3β de isolados de P. vivax utilizando PCR/RFLP do Distrito Mardan mostraram um nível notável de diversidade genética nos genes estudados [...].

Identification and Characterization of the ATG8, a Marker of Eimeria tenella Autophagy / Identificação e Caracterização do ATG8, um marcador de autofagia em Eimeria tenella

Abstract Autophagy plays an important role in maintaining cell homeostasis through degradation of denatured proteins and other biological macromolecules. In recent years, many researchers focus on mechanism of autophagy in apicomplexan parasites, but little was known about this process in avian coccidia. In our present study. The cloning, sequencing and characterization of autophagy-related gene (Etatg8) were investigated by quantitative real-time PCR (RT-qPCR), western blotting (WB), indirect immunofluorescence assays (IFAs) and transmission electron microscopy (TEM), respectively. The results have shown 375-bp ORF of Etatg8, encoding a protein of 124 amino acids in E. tenella, the protein structure and properties are similar to other apicomplexan parasites. RT-qPCR revealed Etatg8 gene expression during four developmental stages in E. tenella, but their transcriptional levels were significantly higher at the unsporulated oocysts stage. WB and IFA showed that EtATG8 was lipidated to bind the autophagosome membrane under starvation or rapamycin conditions, and aggregated in the cytoplasm of sporozoites and merozoites, however, the process of autophagosome membrane production can be inhibited by 3-methyladenine. In conclusion, we found that E. tenella has a conserved autophagy mechanism like other apicomplexan parasites, and EtATG8 can be used as a marker for future research on autophagy targeting avian coccidia.

Resumo A autofagia desempenha um papel importante na manutenção da homeostase celular através da degradação de proteínas desnaturadas e outras macromoléculas biológicas. Nos últimos anos, muitos pesquisadores se concentraram no mecanismo da autofagia em parasitas apicomplexos, mas pouco se sabe sobre esse processo na coccidia aviária. No presente estudo, a clonagem, sequenciamento e caracterização de gene relacionado à autofagia Etatg8 foram investigados pela PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR), mancha ocidental (WB), ensaios indiretos de imunofluorescência (IFAs) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), respectivamente. Os resultados mostraram que o gene Etatg8 de E. tenella possui uma ORF de 375 bp, codificando uma proteína de 124 aminoácidos com estrutura e propriedades semelhantes à de outros apicomplexos. RT-qPCR revelou que Etatg8 é expresso durante os quatro estágios de desenvolvimento de E. tenella. Entretanto, seus níveis transcricionais foram significativamente mais elevados na fase de oocisto não esporulados. Os ensaios de manchas ocidental (WB) e de imunofluorescência (IFA) mostraram que a proteína EtATG8 foi lipidada para ligar-se à membrana do autofagossomo sob condições de deficiência nutritiva (em presença de rapamicina) e se agregar no citoplasma de esporozoítas e merozoítas. No entanto, o processo de produção de membrana do autofagossomo pode ser inibido por um inibidor de autofagia (3-meetiladeninatiladenina, 3-MA). Em conclusão, foi demonstrado que E. tenella tem um mecanismo de autofagia conservado, semelhante ao de outros parasitas apicomplexos, e que EtATG8 pode ser usado como um marcador para futuras pesquisas sobre autofagia direcionada à coccidiose aviária.

A simple, ex vivo phagocytosis assay of Plasmodium vivax merozoites by flow cytometry

As phagocytosis is the first line of defense against malaria, we developed a phagocytosis assay with Plasmodium vivax (P. vivax) merozoites that can be applied to evaluate vaccine candidates. Briefly, after leukocyte removal with loosely packed cellulose powder in a syringe, P. vivax trophozoites matured to the merozoite-rich schizont stages in the presence of the E64 protease inhibitor. The Percoll gradient-enriched schizonts were chemically disrupted to release merozoites that were submitted to merozoite opsonin-dependent phagocytosis in two phagocytic lines with human and mouse antibodies against the N- and C-terminus of P. vivax Merozoite Surface Protein-1 (Nterm-PvMSP1 and MSP119). The resulting assay is simple and efficient for use as a routine phagocytic assay for the evaluation of merozoite stage vaccine candidates.

Receptores del hospedero implicados en la invasión del merozoito de Plasmodium falciparum: revisión / Host receptors involved in the invasion of Plasmodium falciparum merozoite: Review / Receptores do hospedeiro envolvidos na invasão do merozoíto de Plasmodium falciparum: revisão

Introducción. La malaria es un problema de salud pública a nivel mundial y es causada por 5 especies de parásitos apicomplejos del género Plasmodium. La invasión exitosa de los merozoítos al glóbulo rojo es una etapa fundamental en el ciclo de vida del parásito, el cual usa un variado repertorio de ligandos que interactúan de forma específica con receptores presentes en la membrana del glóbulo rojo. Objetivo. Revisar las características moleculares y estructurales de los receptores expresados en la superficie de los glóbulos rojos, implicados en el proceso de invasión del merozoito de Plasmodium falciparum. Método. Revisión descriptiva sobre las características moleculares y estructurales de los receptores de la superficie del glóbulo rojo, los cuales juegan un papel fundamental durante la invasión del merozoíto de Plasmodium falciparum. Esta revisión empezó por la búsqueda de literatura publicada hasta el año 2019 en bases de datos electrónicas, especializadas en la divulgación de investigación biomédica. Se encontraron 127 documentos, de los cuales se seleccionaron 111 y se excluyeron 33 por no cumplir los criterios de inclusión; en total, se analizaron 78 referencias. Conclusión. En esta revisión se resumieron las características moleculares y estructurales de los receptores presentes en el glóbulo rojo importantes en el proceso de invasión del merozoito de P. falciparum. También, se resaltó la importancia de elucidar las diferentes vías de invasión del parásito y así, poder desarrollar alternativas profilácticas o terapéuticas que conduzcan a mitigar o eliminar la malaria

Introduction. Malaria is a public health problem worldwide. It is caused by 5 species of the Apicomplexa genus Plasmodium. The successful invasion of the erythrocyte by Plasmodium merozoites is a critical stage in the life cycle of the parasite, which uses a broad repertoire of ligands that interact in a specific way with receptors expressed on the membrane of the erythrocyte. Objective. To review the molecular and structural characteristics of the receptors expressed on the erythrocyte surface, involved in the process of merozoite invasion by Plasmodium falciparum. Method. Here, we descriptively review of the molecular and structural characteristics of the red blood cell surface receptors, which play a key role during the invasion of Plasmodum falciparum merozoite. To this purpose, we searched the literature published until 2019 in electronic databases specialized in biomedical research. 127 documents were found, of these, 111 were selected, 33 were excluded and 78 references were analyzed. Conclusion. In this review, the molecular and structural characteristics of the receptors expressed on the erythrocytes and important in the process of invasion of P. falciparum merozoites were discussed. With this, we highlight the importance of elucidating the different invasion pathways the parasite, in order to develop prophylactic or therapeutic alternatives that could lead to mitigate or eliminate malaria.

Introdução. A malária é um problema de saúde pública a nível mundial, é causada por 5 espécies de parasitos do Filo Apicomplexa, do gênero Plasmodium. A invasão bem-sucedida de merozoítos nas hemácias, é uma etapa fundamental no ciclo de vida do parasita, que usa um repertório variado de ligandos que interatuam especificamente com receptores presentes na membrana dos glóbulos vermelhos. Objetivo. Revisão descritiva das características moleculares e estruturais dos receptores da superfície dos glóbulos vermelhos, que desempenham um papel fundamental durante a invasão do merozoíto de Plasmodium falciparum. Método. Revisão descritiva das características moleculares e estruturais dos receptores da superfície dos glóbulos vermelhos, que desempenham um papel fundamental durante a invasão do merozoíto de Plasmodium falciparum. Esta revisão foi baseada na pesquisa de literatura publicada até 2019 nas bases de dados eletrônicas especializadas na divulgação de pesquisas biomédicas. Foram encontrados 127 documentos, dos quais 111 foram selecionados e 33 foram excluídos por não apresentarem os critérios de inclusão, analisando um total de 78 referências. Conclusão. Nesta revisão, foram resumidas as características moleculares e estruturais dos receptores presentes nos glóbulos vermelhos, importantes no processo de invasão do merozoíto de P. falciparum. Também foi destacada a importância de elucidar as diferentes vias de invasão do parasita, a fim de desenvolver alternativas profiláticas ou terapêuticas que levem a mitigar ou eliminar a malária.

Low Levels of Polymorphisms and Negative Selection in Plasmodum knowlesi Merozoite Surface Protein 8 in Malaysian Isolates

Human infections due to the monkey malaria parasite Plasmodium knowlesi is increasingly being reported from most Southeast Asian countries specifically Malaysia. The parasite causes severe and fatal malaria thus there is a need for urgent measures for its control. In this study, the level of polymorphisms, haplotypes and natural selection of full-length pkmsp8 in 37 clinical samples from Malaysian Borneo along with 6 lab-adapted strains were investigated. Low levels of polymorphism were observed across the full-length gene, the double epidermal growth factor (EGF) domains were mostly conserved, and non-synonymous substitutions were absent. Evidence of strong negative selection pressure in the non-EGF regions were found indicating functional constrains acting at different domains. Phylogenetic haplotype network analysis identified shared haplotypes and indicated geographical clustering of samples originating from Peninsular Malaysia and Malaysian Borneo. This is the first study to genetically characterize the full-length msp8 gene from clinical isolates of P. knowlesi from Malaysia; however, further functional characterization would be useful for future rational vaccine design.

Longitudinal evaluation of humoral immune response and merozoite surface antigen diversity in calves naturally infected with Babesia bovis, in São Paulo, Brazil / Avaliação longitudinal da resposta immune humoral e diversidade de antígenos de superfície de merozoítos em bezerros naturalmente infectados com Babesia bovis, em São Paulo, Brasil

Abstract Babesiosis is an economically important infectious disease affecting cattle worldwide. In order to longitudinally evaluate the humoral immune response against Babesia bovis and the merozoite surface antigen diversity of B. bovis among naturally infected calves in Taiaçu, Brazil, serum and DNA samples from 15 calves were obtained quarterly, from their birth to 12 months of age. Anti-B. bovis IgG antibodies were detected by means of the indirect fluorescent antibody test (IFAT) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The polymerase chain reaction (PCR) was used to investigate the genetic diversity of B. bovis, based on the genes that encode merozoite surface antigens (MSA-1, MSA-2b and MSA-2c). The serological results demonstrated that up to six months of age, all the calves developed active immunity against B. bovis. Among the 75 DNA samples evaluated, 2, 4 and 5 sequences of the genes msa-1, msa-2b and msa-2c were obtained. The present study demonstrated that the msa-1 and msa-2b genes sequences amplified from blood DNA of calves positive to B. bovis from Taiaçu were genetically distinct, and that msa-2c was conserved. All animals were serologically positive to ELISA and IFAT, which used full repertoire of parasite antigens in despite of the genetic diversity of MSAs.

Resumo A babesiose é uma doença infecciosa economicamente importante que afeta o gado bovino em todo o mundo. Para avaliar longitudinalmente a resposta imune humoral contra B. bovis e a diversidade genética de antígenos de superfície de merozoítos de B. bovis, entre bezerros naturalmente infectados em Taiaçu, Brasil, amostras de soro e DNA de 15 bezerros, foram obtidos trimestralmente, desde o nascimento até aos 12 meses de idade. Os anticorpos IgG para B. bovis foram detectados pelos testes de Imunofluorescência Indireta e Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto. A Reação em Cadeia da Polimerase foi utilizada para investigar a diversidade genética de B. bovis, com base em genes que codificam antígenos de superfície de merozoítos (MSA-1, MSA-2b e MSA-2c). Os resultados da sorologia demonstraram que até seis meses de idade todos os bezerros desenvolveram imunidade ativa contra B. bovis. Entre as 75 amostras de DNA avaliadas, foram obtidas 2, 4 e 5 sequências dos genes msa-1, msa-2b e msa-2c. O presente trabalho demonstrou que as sequências dos genes msa-1 e msa-2b amplificadas do DNA do sangue de amostras positivas a B. bovis de bezerros de Taiaçu foram geneticamente distintas, e msa-2c conservadas. Todos os animais foram soropositivos ao ELISA e ao IFAT, os quais utilizaram o repertório completo de antígenos parasitários, apesar da diversidade genética dos MSAs.

Genetic Diversity and Natural Selection in 42 kDa Region of Plasmodium vivax Merozoite Surface Protein-1 from China-Myanmar Endemic Border

Plasmodium vivax merozoite surface protein-1 (PvMSP1) gene codes for a major malaria vaccine candidate antigen. However, its polymorphic nature represents an obstacle to the design of a protective vaccine. In this study, we analyzed the genetic polymorphism and natural selection of the C-terminal 42 kDa fragment within PvMSP1 gene (Pv MSP142) from 77 P. vivax isolates, collected from imported cases of China-Myanmar border (CMB) areas in Yunnan province and the inland cases from Anhui, Yunnan, and Zhejiang province in China during 2009–2012. Totally, 41 haplotypes were identified and 30 of them were new haplotypes. The differences between the rates of non-synonymous and synonymous mutations suggest that PvMSP142 has evolved under natural selection, and a high selective pressure preferentially acted on regions identified of PvMSP133. Our results also demonstrated that PvMSP142 of P. vivax isolates collected on China-Myanmar border areas display higher genetic polymorphisms than those collected from inland of China. Such results have significant implications for understanding the dynamic of the P. vivax population and may be useful information towards China malaria elimination campaign strategies.

Caracterização da diversidade genética de amostras clínicas de Plasmodium falciparum isoladas de indivíduos de Barcelos - Amazonas utilizando o gene que codifica para a proteína de superfície do merozoíta 2 (msp2) / Characterization of the genetic diversity of Plasmodium falciparum isolated from clinical samples of individuals from Barcelos - Amazonas using the gene encoding the merozoite surface protein (msp2)

INTRODUCÃO: A complexa diversidade genética do Plasmodium falciparum é emparte responsável pela evasão da resposta imune do hospedeiro, pelo surgimentoda resistência aos fármacos e pela dificuldade no desenvolvimento de uma vacinaanti-malárica eficaz. Estudos sobre a biologia deste parasito se concentramfundamentalmente em áreas holo e hiperendêmicas de malária na Áfricasubsaariana. Trabalhos realizados na região Amazônica, ainda são escassos no quese refere à diversidade genética de populações naturais de P. falciparum. Esteestudo analisou a diversidade genética de P. falciparum isolados de indivíduosprovenientes da região do médio rio Negro, Amazonas utilizando como alvo o geneque codifica para a proteína de superfície do merozoíta 2. METODOLOGIA: Oestudo foi realizado em Barcelos, um município de alto risco epidemiológico paramalária com uma média anual de 5.000 casos nos últimos cinco anos (IPAmédio=156,4/1000). Foram avaliadas 79 amostras isoladas de indivíduos queapresentaram malária clínica ou infecção assintomática. Os DNAs genômicosextraídos foram submetidos à reação em cadeia da polimerase (PCR) para aconfirmação do diagnóstico de infecção pelo P. falciparume em seguida foi feita umaPCR-nested, para amplificação da região do bloco 3 do gene msp2 paradiferenciação das famílias alélicas (3D7 e FC27) e a diversidade intra-família foiobservada após digestão com a enzima HinfI. RESULTADOS: Só foi encontrada afamilia 3D7 nas amostras estudadas. Dois diferentes genótipos foram encontradoscirculando na área, caracterizados pela combinação dos fragmentos 16 pb, 108 pb,349 (genotipo 1) e 16 pb, 108 pb, 400pb (genotipo 2). Foi observado que só doisindivíduos com malária clinica portavam os dois genótipos simultaneamente...

INTRODUCTION: The complex genetic diversity of Plasmodium falciparum is partlyresponsible for the evasion of the host immune response, the emergence of drugresistance and the difficulty in developing an effective anti-malarial vaccine. Studieson the biology of this parasite are mainly concentrated in holo and hyperendemicmalaria areas in sub-Saharan Africa. Research in the Amazon region, is scarce inrelation to the genetic diversity of natural populations of P. falciparum. This studyanalyzed the genetic diversity of P. falciparum isolates from individuals of the MiddleRio Negro, Amazon in Brazil, using the gene coding for the merozoite surface protein2 (MSP2). METHODOLOGY: The study was conducted in Barcelos, a malaria highepidemiological risk municipality, with an annual average of 5,000 cases in the lastfive years (mean IPA = 156.4 / 1000). We evaluated 79 samples isolated fromsubjects presenting clinical malaria or asymptomatic infection. The extracted genomicDNA was subjected to polymerase chain reaction (PCR) to confirm the diagnosis ofinfection with P. falciparum. A PCR-nested was made for amplification of the genemsp2 block 3 region for differentiation of allelic families (3D7 and FC27); intrafamilydiversity was observed after digestion with the enzyme HinfI. RESULTS: Only family3D7 was observed in the samples. Two different genotypes were found circulating inthe area, characterized by the combination of fragments 16 bp, 108 bp, 349(genotype 1) and 16 bp, 108 bp, 400bp (genotype 2). It was observed that only twoindividuals with clinical malaria carried two genotypes simultaneously...

Characterization of Pv92, a Novel Merozoite Surface Protein of Plasmodium vivax

The discovery and understanding of antigenic proteins are essential for development of a vaccine against malaria. In Plasmodium falciparum, Pf92 have been characterized as a merozoite surface protein, and this protein is expressed at the late schizont stage, but no study of Pv92, the orthologue of Pf92 in P. vivax, has been reported. Thus, the protein structure of Pv92 was analyzed, and the gene sequence was aligned with that of other Plasmodium spp. using bioinformatics tools. The recombinant Pv92 protein was expressed and purified using bacterial expression system and used for immunization of mice to gain the polyclonal antibody and for evaluation of antigenicity by protein array. Also, the antibody against Pv92 was used for subcellular analysis by immunofluorescence assay. The Pv92 protein has a signal peptide and a sexual stage s48/45 domain, and the cysteine residues at the N-terminal of Pv92 were completely conserved. The N-terminal of Pv92 was successfully expressed as soluble form using a bacterial expression system. The antibody raised against Pv92 recognized the parasites and completely merged with PvMSP1-19, indicating that Pv92 was localized on the merozoite surface. Evaluation of the human humoral immune response to Pv92 indicated moderate antigenicity, with 65% sensitivity and 95% specificity by protein array. Taken together, the merozoite surface localization and antigenicity of Pv92 implicate that it might be involved in attachment and invasion of a merozoite to a new host cell or immune evasion during invasion process.

Predicción de unión de péptidos de Plasmodium falciparum al HLA clase II. Probabilidad, combinatoria y entropía aplicadas a las proteínas MSP-5 y MSP-6 / Plasmodium falciparum binding peptides prediction to HLA class II. Probability, combinatory and entropy applied to MSP-5 and MSP-6 proteins

Las proteínas de superficie del merozoíto (MSP) son de importancia en la invasión parasitaria al glóbulo rojo. La proteína MSP-5, encontrada en merozoítos libres, tiene un papel en la inmunización de ratones al P. falciparum y P. yoelii, pese a lo cual algunos estudios cuestionan su rol en la invasión. La proteína MSP-6 forma junto con MSP-1 y MSP-7 un complejo en la superficie del merozoíto, liberado del parásito cerca del momento de la invasión al glóbulo rojo. Con el fin de predecir el fenómeno de unión de péptidos de las proteínas de superficie MSP-5 y MSP-6, se aplicó una teoría de unión al HLA clase II, a la totalidad de secuencias de 20 aminoácidos de tales moléculas. Se calcularon los valores de probabilidad, combinatoria y entropía de 168 secuencias nonámeras sobrelapadas de la proteína MSP-5 y 228 de MSP-6. Por último se aplicó la teoría de unión a todos los péptidos nonámeros de tres proteínas construidas computacionalmente, cada una con una longitud de 500 aminoácidos. Para la proteína MSP-5 se predijo un total de 31 secuencias asociadas al macroestado de unión y 137 al de no unión, mientras que se predijo la existencia de 35 secuencias asociadas al macroestado de unión para MSP-6 y 193 al de no unión. Se encontraron respectivamente 100, 111 y 91 secuencias predichas de unión para las tres proteínas teóricas construidas. La predicción teórica de unión de péptidos es útil para facilitar el desarrollo de vacunas, al evidenciar el orden físico-matemático subyacente al fenómeno.(AU)

Avaliação do potencial das proteínas de superfície de merozoítas de Plasmodium vivax (PvMSP-9 e PvMSP-3) como candidatas a compor uma vacina contra a malária / Assessing the potential of the surface proteins of merozoites of Plasmodium vivax (PvMSP-9 and PvMSP-3) as candidates to compose a malaria vaccine

As proteínas 9 e 3 de Superfície de Merozoítas de P. vivax (PvMSP9 e PvMSP3) vem sendo consideradas como importantes candidatas potenciais a uma vacina antimalárica principalmente pela: 1) localização na superfície do merozoíta; 2) homologia com plasmódios simianos e P. falciparum; 3) habilidade de IgG específicas em inibir a invasão dos merozoítas; 4) alta imunogenicidade em ensaios realizados em modelos animais. Entretanto, estudo da resposta imune em humanos para determinar o potencial de ambas como candidatas a vacina, embora fundamental, não havia sido realizado. Deste modo, descrevemos, em 3 artigos, o potencial das proteínas PvMSP9 e PvMSP3 como candidatas a compor uma vacina antimalárica através da caracterização da resposta imune naturalmente adquirida de indivíduos residentes em áreas endêmica. No primeiro trabalho, demonstramos que a PvMSP9 apresenta epitopos de células T fortemente reconhecidos e que são capazes de estimular a produção de IFN-gama e IL-4, além de uma potente resposta imune humoral com alta frequência e índices de reatividade de anticorpos IgG e subclasses (principalmente IgG1 e IgG2) para as regiões repetitivas espécie-específicas. No segundo trabalho, observamos que os epitopos de célula T descritos, apresentam propriedades promíscuas, sendo reconhecidos por indivíduos naturalmente expostos que apresentam diferentes grupos alélicos de HLA-DR e HLA-DQ, demonstrando que caso estes peptídeos fossem utilizados como imunógenos não haveria influência do genótipo de HLA na resposta imune celular. Por fim, observamos que a PvMSP3 é altamente reconhecida por anticorpos naturalmente adquiridos por indivíduos de área endêmica de malária, com altas frequências e concentrações de anticorpos citofílicos IgG1 e IgG3. Além disso, pudemos demonstrar, por spot-synthesis, que existem 25 epitopos de células B distribuídos por toda a extensão da proteína, passando por regiões conservadas e polimórficas. Deste modo, os dados gerados nesses trabalhos demonstram que as proteínas PvMSP9 e PvMSP3 são candidatas potenciais a compor uma vacina antimalárica, apresentando epitopos de células T e B capazes de gerar uma marcante resposta imune, com altos títulos de anticorpos citofílicos e uma potente resposta celular.

Genetic structure of Plasmodium vivax population assessed by sequence analysis of the merozoite surface protein 3 beta gene

The endemicity and transmission intensity levels of malaria are related to genetic diversity of the parasites. Merozoite surface protein 3beta [MSP3beta] is an important marker for assessing the polymorphic nature of Plasmodium vivax while it is also a vaccine candidate against the parasite. In this study we investigated the genetic structure of P. vivax population by sequence analysis of a polymorphic region of the P. vivax MSP3beta gene in isolates from Iran. Blood samples were collected from 100 patients with clinical symptoms. DNA was extracted and the target gene was amplified by polymerase chain reaction [PCR]. The sequences of 17 samples were used for sequence analysis using nucleotide Blast search and ClustalW multiple alignment. Phylogenetic tree was derived to describe the geographical branching and relationships. A large number of nucleotide insertions and deletions were observed in the sequences of polymorphic region of PvMSP3beta gene that were not specific in each biotype. Single nucleotide polymorphism [SNP] was found extensively in the sequences. The phylogenetic analysis did not show any significant geographical branching. The lack of any geographical branching and extensive polymorphism in MSP3beta gene of P. vivax isolates suggests that more investigations are needed to find a more suitable gene in order to develop a vaccine

Estudo das respostas imunes celular e humoral frente à proteína 9 de superfície de merozoítas de plasmodium vivax (PVMSP-9), em indivíduos naturalmente expostos à infecção / Study of cellular and humoral immune responses against the protein surface 9 of merozoites of Plasmodium vivax (PvMSP-9) in individuals naturally exposed to infection

A proteína 9 de superfície de merozoíta de Plasmodium vivax (PvMSP9) apresenta homologia com diversas espécies incluindo a proteína ABRA de P. falciparum. PvMSP9 é composta por 979 aminoácidos, possui uma sequência sinal hidrofóbica e um grupo de 4 cisteínas na região N-terminal (PvMSP9-NT), e dois blocos de sequências repetitivas espécie específicas na região C-terminal (PvMSP9-RI e PvMSP9-RII). Estudos anteriores demonstraram que anticorpos monoclonais dirigidos para o P. vivax e anticorpos policlonais contra a MSP9 de P. cynomolgi são capazes de inibir a invasão de eritrócitos in vitro e que a PvMSP9 e altamente imunogênica em camundongos. No presente estudo, avaliamos a reatividade celular e de anticorpos contra a PvMSP9 em indivíduos naturalmente expostos à infecção. Em um estudo transversal realizado em Porto Velho (RO), células e soro de indivíduos de Ribeirinha (comunidade nativa da região que reside nas margens do rio Madeira, n=188), e Colina (comunidade de migrantes que vivem em áreas rurais perto da capital Porto Velho, n=122), foram testados por ELISPOT quanto à produção de IFN-gama e IL-4 sob estímulo de 11 peptídeos sintéticos, e por ELISA quanto a reatividade dos anticorpos IgG utilizando proteínas recombinantes representando a PvMSP-9. Nossos resultados mostram que o perfil de citocinas na resposta celular, foi diferente nas duas comunidades. Em Ribeirinha, a população nativa, a frequência de indivíduos positivos para a secreção das citocinas IFN-gama e IL-4 após estímulo com os peptídeos sintéticos foi similar. Os peptídeos mais imunogênicos induzindo a produção de IFN-gama foram pK (29,5por cento) e pA (23,8por cento) e de IL-4, pL (22,7por cento) e pA (17,3por cento). Em Colina, a população migrante, a frequência de positivos é principalmente para a secreção de IFN-gama, onde pE (29.5por cento) e pL (30.3por cento) foram os mais imunogênicos, e para a secreção de IL-4 as maiores frequências observadas...

Antibody Responses to the Recombinant Circumsporozite Protein, Merozoite Surface Protein, and Duffy Binding Protein Antigens of Plasmodium vivax in Korea / 대한진단검사의학회지

BACKGROUND: Plasmodium vivax circumsporozoite protein (CSP), merozoite surface protein (MSP) and Duffy binding protein (DBP) are functionally important conserved proteins and may have an important role in developing antigens. The aim of this study was to develop recombinant CSP, MSP, and DBP antigens, to evaluate their diagnostic usefulness, and to analyze the prevalence of seroreactivity against P. vivax in five different regions in Korea. METHODS: To construct recombinant CSP, MSP, and DBP antigens from P. vivax, DNA obtained from specimens previously diagnosed as P. vivax was used. To evaluate diagnostic usefulness of recombinant CSP, MSP, and DBP antigens from P. vivax, sera from 45 patients with P. vivax and 48 normal controls including 4 patients with Plasmodium falciparum were used. For the epidemiologic study, a total of 1, 014 serum samples obtained from five different regions in Korea were used. RESULTS: The sensitivity of the IgG antibody against the P. vivax recombinant CSP, MSP, DBP antigens and the antigens mixture of these proteins were 75.6%, 62.2%, 68.9%, and 97.8%, and the specificity were 92.1%, 84.2%, 81.6%, and 97.4%, respectively. The seropositivity against P. vivax recombinant antigens was highest in Cheolwon province. The IgG seropositivity against P. vivax recombinant CSP, MSP and DBP was 2.0%, 1.2%, and 1.5%, respectively. There were no significant differences in seroreactivity against P. vivax between each recombinant protein and each five different regions in Korea. CONCLUSIONS: Newly constructed recombinant CSP, MSP and DBP were useful in the detection of antibodies against the P. vivax antigen.

Evaluation of LG Malaria Anti-PvTM for Diagnosis of Plasmodium vivax Malaria in the Republic of Korea / 대한임상병리학회지

BACKGROUND: In the Republic of Korea, Plasmodium vivax malaria, which had disappeared since 1984, re-emerged in 1993. Currently, malaria is becoming a serious public health problem in the Republic of Korea. The diagnosis of malaria has relied on microscopic examination such as thin and thick blood smears. However, even for expert microscopists, this test is a laborious and time-consuming procedure. Therefore, the development of a reliable, easy, and convenient diagnostic test is crucial. Recently, the LG malaria anti-PvTM enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit for the detection of a specific antibody against the merozoite surface protein (MSP) of P. vivax was developed. The aim of this study was to evaluate the diagnostic kit for P. vivax malaria in the Republic of Korea. METHODS: To determine the usefulness of the LG malaria anti-PvTM as a diagnostic kit for vivax malaria, a total of 59 serum samples from patients with P. vivax malaria were tested. The patients were diagnosed microscopically and the parasitemia index of their blood was calculated. Sera from 203 uninfected healthy blood donors, which were microscopically negative for Plasmodium vivax, were used as negative controls. RESULTS: The sensitivity and specificity of the LG malaria anti-PvTM were 98.31% (58/59) and 98.03% (199/203), respectively. The false-positive and false-negative rates were 1.97% (4/203) and 1.69% (1/59), respectively. CONCLUSIONS: The diagnostic kit, LG malaria anti-PvTM, might be a useful tool for diagnosis and screening of P. vivax malaria in Korea.

Cryptosporidium Infection of Human Intestine: An Electron Microscopic Observation

Protozoa of the genus Cryptosporidium are small coccidian parasite known to infect the mucosal epithelium of a variety of animals including human, causing fatal course in immunodeficient patients as well as self-limited illness in healthy individuals. Various life cycle stages including trophozoite, meront, merozoite, gametocyte and oocyst in infected mucosa are a diagnostic feature. Electron microscopy (EM) provides sufficient findings for genus and species identification of this parasitic organism. The authors presented scanning and transmission EM findings of Cryptosporidium parvum infection in two children: one with acute lymphoblastic leukemia and the other without any evidence of immune compromise.

A Case of Vivax Malaria Who Showed only Released Merozoites and Ruptured Schizonts Form / 감염

We report a case of vivax malaria that showed ruptured form of merozoite only in the peripheral blood. A 28-year old man was admitted to Korea University hospital because of irregular high fever, chill and abdominal pain. The peripheral blood smear, showed only small merozoites which seemed to have been recently released from schizonts and destroyed remnants form of schizonts and did not show any forms of malaria parasite such as ring forms, mature trophozoites, schizonts, and gametocytes. On acridine orange fluorochrome stain, we could not find any suspected forms of malaria. However, we detected parasite LDH which is specific to Plasmodium vivax. Malaria treatment was done to the patient, and he is now under follow up in local hospital.