A simplified and miniaturized glucometer-based assay for the detection of β-glucosidase activity / 浙江大学学报（英文版）（B辑：生物医学和生物技术）

β-Glucosidase activity assays constitute an important indicator for the early diagnosis of neonatal necrotizing enterocolitis and qualitative changes in medicinal plants. The drawbacks of the existing methods are high consumption of both time and reagents, complexity in operation, and requirement of expensive instruments and highly trained personnel. The present study provides a simplified, highly selective, and miniaturized glucometer-based strategy for the detection of β-glucosidase activity. Single-factor experiments showed that optimum β-glucosidase activity was exhibited at 50 °C and pH 5.0 in a citric acid-sodium citrate buffer when reacting with 0.03 g/mL salicin for 30 min. The procedure for detection was simplified without the need of a chromogenic reaction. Validation of the analytical method demonstrated that the accuracy, precision, repeatability, stability, and durability were good. The linear ranges of β-glucosidase in a buffer solution and rat serum were 0.0873-1.5498 U/mL and 0.4076-2.9019 U/mL, respectively. The proposed method was free from interference from β-dextranase, snailase, β-galactosidase, hemicellulase, and glucuronic acid released by baicalin. This demonstrated that the proposed assay had a higher selectivity than the conventional dinitrosalicylic acid (DNS) assay because of the specificity for salicin and unique recognition of glucose by a personal glucose meter. Miniaturization of the method resulted in a microassay for β-glucosidase activity. The easy-to-operate method was successfully used to detect a series of β-glucosidases extracted from bitter almonds and cultured by Aspergillus niger. In addition, the simplified and miniaturized glucometer-based assay has potential application in the point-of-care testing of β-glucosidase in many fields, including medical diagnostics, food safety, and environmental monitoring.

Effect of dietary fiber concentrates on growth performance, gut morphology and hepatic metabolic intermediates in jundiá (Rhamdia quelen) / Efeito de concentrados de fibra alimentar sobre o desempenho de crescimento, morfologia intestinal e intermediários metabólicos hepáticos de jundiás (Rhamdia quelen)

A study was conducted to investigate the effect of Dietary Fiber Concentrates (DFCs) on growth performance, gut morphology, and hepatic metabolic intermediates in jundiá (Rhamdia quelen). At the end of the trial, growth and intestinal villus height was significantly (P< 0.05) higher in fish fed diets supplemented with DFCs. However, the animals in commercial prebiotic group showed higher values for this variable compared to the other treatments. Regarding the thickness of the epithelium bowel, it was greater in the Control group compared to animals supplemented with ß-glucan+mannan. Likewise, treatment with commercial prebiotic showed higher values of epithelium bowel compared to the DFCs. The fish supplemented with DFCs, had higher glycogen storage compared to the control group. These results indicate that DFCs can be considered as a beneficial dietary supplement for improving growth performance, gut morphology, and hepatic metabolic intermediates of jundiá.(AU)

O presente estudo foi conduzido para investigar o efeito de concentrados de fibras alimentares (CFAs) sobre o desempenho de crescimento, a morfologia intestinal e os parâmetros intermediários metabólicos hepáticos de jundiás (Rhamdia quelen). No final do experimento, o crescimento e a altura das vilosidades intestinais foram significativamente (P<0,05) maiores em peixes alimentados com dietas suplementadas com CFAs. No entanto, os animais suplementados com prebiótico comercial apresentaram valores mais elevados para essa variável em comparação com os outros tratamentos. Em relação à espessura do epitélio intestinal, esta foi maior nos animais do grupo controle em comparação com os animais suplementados com ß-glucano + manano. Da mesma forma, os peixes suplementados com prebiótico comercial apresentaram valores mais elevados do epitélio intestinal em comparação com os peixes suplementados com CFAs. Os peixes suplementados com CFAs obtiveram maior armazenamento de glicogênio em relação ao grupo controle. Esses resultados indicam que os CFAs podem ser utilizados como um suplemento alimentar benéfico para melhorar o desempenho do crescimento, a morfologia intestinal e os intermediários metabólicos hepáticos do jundiá.(AU)

Clonagem e análise da expressão de genes de proteínas de mamão papaia com atividade inibitória sobre poligalacturonases fúngicas / Cloning and expression analysis of papaya genes encoding proteins with inhibitory activity against fungal polygalacturonases

As proteínas inibidoras de poligalacturonases (PGIPs) presentes na parede celular são capazes de limitar o potencial destrutivo da poligalacturonase (PG) fúngica e, assim, constituem um tipo importante dentre os diversos sistemas de defesa do tecido vegetal frente à infecção fúngica. No mamão, o ataque fitopatogênico é o principal causador de danos pós-colheita, e sua alta susceptibilidade pode estar relacionada com a baixa eficácia ou pouca abundância dos meios de defesa anti-fitopatogênica. Uma vez que isso pode estar relacionado com as PGIPs e nada se conhece sobre o papel dessas proteínas nesse fruto, o objetivo do trabalho foi clonar os genes das PGIPs de mamoeiro e definir seu padrão de expressão em diferentes órgãos e tecidos e ao longo do amadurecimento. Para tanto, foram identificadas no genoma do mamoeiro, a partir de critérios que definem a identidade de uma PGIP, duas prováveis sequências dentre 13 candidatas iniciais. Ambas foram clonadas a partir das sequências genômicas e de cDNA, sequenciadas e sua identidade confirmada, sendo denominadas Cppgip4 e Cppgip6. As análises de expressão relativa em diversos tecidos e idades fisiológicas do mamoeiro demonstraram que os dois genes apresentaram diminuição da expressão com o desenvolvimento dos frutos, sendo que com a polpa apresentou redução dos níveis de expressão relativa de Cppgip4 em até 18 vezes dos 30 dias pós-antese (DPA) ao 9 dias pós-colheita (DPC). Na casca também houve redução significativa da expressão com o desenvolvimento. Para a expressão absoluta, nos frutos, sementes, caules, raízes e folhas, o número de cópias de ambos os transcritos decresceu com o desenvolvimento, sendo cerca de cem mil vezes mais abundante para Cppgip6 que para Cppgip4. As tentativas de expressão de proteínas recombinantes em Pichia pastoris não geraram resultado positivo, provavelmente em virtude das condições ideais de indução ainda não terem sido estabelecidas corretamente para o ensaio. A atividade de PGIPs extraídas diretamente do tecido foi medida por análise de difusão em ágar empregando pectinase de Aspergillus niger e revelou uma tendência à diminuição da porcentagem de inibição à medida que os frutos se desenvolveram, em concordância com os resultados da análise por qPCR. O conjunto de resultados sugere que a expressão varia com o estádio de desenvolvimento do fruto e é tecido-específica, possivelmente em resposta à diferente susceptibilidade dos tecidos ao ataque fitopatogênico, indicando que menores níveis de transcritos e atividade no amadurecimento, período de maior susceptibilidade, poderiam sinalizar para a regulação do processo degradativo marcando o início da senescência

Polygalacturonase inhibiting proteins (PGIPs) present in plant cell walls are able to inhibit the destructive action of fungal polygalacturonase (PG). In this way, they constitute an important type of plant defense system against fungal infections. In papaya fruit, the pathogenic attack is the main cause of post harvesting loss, and its high susceptibility may be related to the low efficiency or low abundance of anti-phytopathogenic defense. Since this fact could be related to PGIPs expression and little is known about the response of these proteins in the fruit, the aim of the present work was to clone the genes of PGIPs papaya fruit and set their expression pattern in different organs and tissues throughout fruit ripening. Thus, two probable PGIP sequences among 13 initial candidates were identified in the papaya genome by using specific criteria. Both sequences were cloned from cDNA and genomic samples, sequenced and confirmed its identity, and then being named Cppgip4 and Cppgip6. Analysis of relative expression in various tissues at different physiological stages demonstrated that both genes were down regulated during fruit development. The relative expression levels of Cppgip4 in papaya pulp was reduced by 18 times from the 30 days post-anthesis (DPA) to the 9 days post-harvest (DPH). Similarly, gene expression in papaya peel was significant down regulated during fruit development. Absolute expression analysis revealed gene expressions in the fruit pulp, seed, stem, root and leaf were also down regulated within development. Moreover, Cppgip6 gene expression was a hundred thousand times more abundant than Cppgip4. The recombinant protein expression in Pichia pastoris did not result positive, probably because of the ideal conditions of induction have not been properly established the yet. The activity of PGIPs extracted directly from the tissue was measured by the agar diffusion assay using pectinase from Aspergillus niger and showed decrease of inhibition during fruit developed in accordance with the results of the qPCR analysis. Based on the results it is possible to suggest the expression of these genes varies temporally with the developmental stage of the fruit and is tissue-specific, possibly in response to the different susceptibility of tissues to pathogenic attack. In addition, the lowest levels of PGIP expression were achieved at the fruit ripening, when the susceptibility to fungal infection is high and could signal for regulating the degradation process characterized by the onset of senescence

Constitutive and inducible pectinolytic enzymes from Aspergillus flavipes FP-500 and their modulation by pH and carbon source / Enzimas pectinolíticas constitutivas e indutíveis de Aspergillus flavipes FP-500 e sua modulação pelo pH e fonte de carbono

Growth and enzymes production by Aspergillus flavipes FP-500 were evaluated on pectin, polygalacturonic acid, galacturonic acid, arabinose, rhamnose, xylose, glycerol and glucose at different initial pH values. We found that the strain produced exopectinases, endopectinases and pectin lyases. Exopectinases and pectin lyase were found to be produced at basal levels as constitutive enzymes and their production was modulated by the available carbon source and pH of culture medium and stimulated by the presence of inducer in the culture medium. Endo-pectinase was basically inducible and was only produced when pectin was used as carbon source. Our results suggest that pectinases in A. flavipes FP-500 are produced in a concerted way. The first enzyme to be produced was exopectinase followed by Pectin Lyase and Endo-pectinase.

Avaliou-se o crescimento e a produção de enzimas por Aspergillus flavipes FP-500 em pectina, ácido poligalacturônico, ácido galacturônico, arabinose, ramnose, xilose, glicerol e glicose, em diferentes valores de pH inicial. Verificamos que a cepa produziu exopectinases, endopectinases e pectina liases. Exopectinases e pectina liases foram produzidas em níveis basais como enzimas constitutivas e sua produção foi modulada pela fonte de carbono disponível e pelo pH do meio de cultura e estimulada pela presença de indutores no meio de cultura. Endopectinase foi indutível e produzida somente quando pectina foi utilizada como fonte de carbono. Nossos resultados sugerem que as pectinases de A. flavipes FP-500 são produzidas de forma planejada. A primeira enzima a ser produzida foi expopectinase, seguida por pectina liase e endopectinase.

Novel process for the simultaneous extraction and degumming of banana fibers under solid-state cultivation

Various process parameters for the production of polygalacturonase by Streptomyces lydicus under solid-state fermentation were optimized. The optimum particle size of wheat bran for polygalacturonase production was in the range of 500-1000 µm. Initial moisture content of 70 percent was found to be the optimum for enzyme production. The most suitable inoculum size was 1.25 x 10(5) CFU/mL and the optimum incubation temperature was 30ºC. Addition of carbon sources resulted in 37 percent increase in enzyme yield (425 U/g), whereas no significant enhancement was obtained on nitrogen supplementation. Maximum enzyme yield was recorded at 72 h. When compared to the initial production medium (108.5 U/g), the enzyme yield was 3.9 fold after optimization. Solid-state fermentation was effectively employed to develop a novel process for the simultaneous extraction and degumming of banana fibers. Streptomyces lydicus was allowed to grow on wheat bran medium in which banana leaf sheath pieces were incorporated and the fiber bundles were separated after a two-step fermentative process.

Vários parâmetros de processo de produção de poligalacturonase por Streptomyces lydicus por fermentação em estado sólido foram otimizados. O tamanho ótimo de partícula de farelo de trigo para a produção de poligalacturonase esteve na faixa de 500 a 1000 mm. O teor inicial de umidade de 70 por cento foi o melhor para a produção da enzima. O inóculo inicial mais adequado foi de 1,25 x 10(5) UFC/mL e a temperatura ótima de incubação foi 30ºC. A adição de fontes de carbono resultou em aumento de 37 por cento no rendimento da enzima (425U/g), enquanto que a suplementação com nitrogênio não melhorou o rendimento. O rendimento máximo da enzima foi obtido em 72h. A otimização resultou em um aumento de 3,9 vezes na quantidade de enzima produzida inicialmente (108,5U/g). A fermentação em estado-sólido foi eficiente para o desenvolvimento de um novo processo de extração e simultânea degomagem. Streptomyces lydicus foi cultivado em meio de farelo de trigo acrescentado de fragmentos de folhas de banana, sendo os feixes de fibras separados após um processo de fermentação em dois passos.

Estudio de la actividad enzimatica de poligalacturonasaen la corteza de pitaya amarilla (Acanthocereus pitajaya) / Polygalacturonase Activity in Yellow Pitaya Peel (Acanthocereus pitajaya)

Se determinó la actividad poligalacturonasa en corteza de pitaya amarilla (Acanthocereus pitajaya). El buffer fosfato de sodio 20 mM pH 7,0 con NaCl 0,5 M se constituyó en el sistema más efectivo para la extracción. Se obtuvieron valores óptimos de actividad a pH 5,0 en buffer citratos, a una temperatura de 40 °C. Los valores de KM y VMÁX hallados para esta enzima fueron 2,9 mg ácido poligalacturónico/ml y 0,076 nmol de azúcares reductores/s, respectivamente. Los resultados muestran que la poligalacturonasa está vinculada con el ablandamiento de este fruto.

Evoluçäo da atividade e expressäo de enzimas e modificaçäo de polímeros da parede celular de mamöes durante o amadurecimento / Evolution of the activity and enzyme expression and modification of the cellular wall of papayas during the ripening

Foram analisadas expressão dos genes e atividades enzimáticas da pectinametilesterase, beta-galactosidase e poligalacturonase, bem como modificação in situ de polímeros da parede celular de frutos de mamão em diversos estádios de amadurecimento. Após a clonagem e sequenciamento de fragmentos do gene para cada enzima sua expressão foi analisada por Northern blot. A imunolocalização dos polímeros da parede foi feita por microscopia eletrônica. De acordo com os resultados apresentados, é possível evidenciar indução da transcrição do gene para a beta-galactosidase, presença constante de transcrito para a poligalcaturonase e ausência de evidências da expressão do gene para pectinametilesterase...

Screening of bacterial strains for pectinolytic activity: characterization of the polygalacturonase produced by "Bacillus" sp

One hundred sixty eight bacterial strains, isolated from soil and samples of vegetable in decomposition, were screened for the use of citrus pectin as the sole carbon source. 102 were positive for pectinase depolymerization in assay plates as evidenced by clear hydrolization halos. Among them, 30(per cent) presented considerable pectinolytic activity. The cultivation of these strains by submerged and semi-solid fermentation for polygalacturose production indicated that five strains of "Bacillus" sp. produced high quantities of the enzyme. The physico-chemical characteristics, such as optimum pH of 6.0-7.0, optimum temperatures between 45ºC and 55ºC, stability at temperatures above 40ºC and in neutral and alkaline pH, were determined