Yersinia pestis detection by loop-mediated isothermal amplification combined with magnetic bead capture of DNA

ABSTRACT We developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of Y. pestis by targeting the 3a sequence on chromosome. All 11 species of the genus Yersinia were used to evaluate the specificity of LAMP and PCR, demonstrating that the primers had a high level of specificity. The sensitivity of LAMP or PCR was 2.3 or 23 CFU for pure culture, whereas 2.3 × 104 or 2.3 × 106 CFU for simulated spleen and lung samples. For simulated liver samples, the sensitivity of LAMP was 2.3 × 106 CFU, but PCR was negative at the level of 2.3 × 107 CFU. After simulated spleen and lung samples were treated with magnetic beads, the sensitivity of LAMP or PCR was 2.3 × 103 or 2.3 × 106 CFU, whereas 2.3 × 105 or 2.3 × 107 CFU for magnetic bead-treated liver samples. These results indicated that some components in the tissues could inhibit LAMP and PCR, and liver tissue samples had a stronger inhibition to LAMP and PCR than spleen and lung tissue samples. LAMP has a higher sensitivity than PCR, and magnetic bead capture of DNAs could remarkably increase the sensitivity of LAMP. LAMP is a simple, rapid and sensitive assay suitable for application in the field or poverty areas.

Aplicação da técnica Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) no desenvolvimento de um teste para o diagnóstico da peste / Application of the technique Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in developing a test for the plague diagnosis

A peste, infecção causada pela bactéria Yersinia pestis, é uma zoonose primária de roedores, geralmente transmitida por pulgas, que infecta humanos e outros mamíferos. O diagnóstico bacteriológico tradicional da peste pode ser comprometido pela qualidade das amostras coletadas em áreas remotas, transportadas inadequadamente e recebidas no laboratório semanas após a coleta. Técnicas de diagnóstico molecular dispensam o cultivo e são exequíveis quando as bactérias estão inviáveis ou em amostras multicontaminadas. Métodos moleculares convencionais (PCR, qPCR, Nested-PCR) requerem equipamentos sofisticados para amplificação e visualização dos resultados, impedindo seu uso em laboratórios menos equipados. A amplificação isotérmica mediada por loop (Loop-mediated isothermal amplification - LAMP), uma variação da PCR convencional, utiliza enzima que permite amplificação isotérmica, apresenta alta especificidade, sensibilidade, rapidez e custo reduzido, sendo utilizada na detecção de diversos patógenos. Esta técnica emprega de quatro a seis primers e a enzima Bst DNA polimerase, que além da atividade de síntese, atua abrindo a fita dupla de DNA. O resultado da amplificação é visualizado no próprio tubo, a olho nu. O objetivo deste projeto foi aplicar a técnica LAMP no desenvolvimento de um teste para o diagnóstico da peste. Foram construídos cinco primers específicos para amplificação do gene caf1, exclusivo de Y. pestis, utilizados em ensaios com o DNA da cepa Y. pestis A1122, para determinar as concentrações ótimas dos reagentes, temperatura de incubação (60°C, 63°C e 65°C) e tempo de duração da reação (15, 30, 45, 60 e 90 minutos). As reações foram incubadas em banho maria. A amplificação foi visualizada diretamente nos tubos contendo SYBR® Safe ou SYBR® Green I. Foi observado que a partir de 45 minutos de reação ocorre amplificação do gene caf1, nas três temperaturas testadas. Além disso, a técnica mostrou-se específica e sensível, detectando até 10 pg de DNA de Y. pestis.

Prompt laboratory diagnosis in timely containment of a plague outbreak in India.

A focal outbreak of pneumonic plague occurred in a hamlet of village Hatkoti, district Shimla, Himachal Pradesh in the first fortnight of February, 2002. A total of 16 cases with 4 deaths were reported. Diagnosis of plague was confirmed by the laboratory in 10 (63%) cases. Y. pestis was isolated from clinical samples of 3 cases and confirmed by bacteriophage lysis. Molecular tests confirmed the presence of Y. pestis specific pla and F1 genes in 4 cases; DNA fingerprinting had identity with the known sequence of plague bacilli. Paired samples from 5 cases showed more than 4 fold rise and 1 case showed more than 4 fold fall in antibodies against F1 antigen of Y. pestis. The present communication emphasises that timely and systematic laboratory investigations give confirmatory diagnosis in shortest possible time which forms the backbone of the outbreak control in a timely fashion and prevents confusion and controversy.

Plague: a decade since the 1994 outbreaks in India.

The severe 1994 plague outbreaks in Surat and Beed drew attention to plague as a continuing source of both natural and potentially manmade disease. This article written a decade later reviews various aspects of Plague not only as a disease but also as an infectious disaster.

Avaliação da técnica Nested-PCRTbU para aplicação no diagnóstico da peste / Evaluation of Nested-PCRTbU technique for application in the diagnose of pestis

O diagnóstico de certeza da peste baseia-se na identificação e isolamento da Y. pestis pelo cultivo de material de pacientes humanos, de roedores e suas pulgas. No Brasil, os casos humanos e as epizootias de peste ocorrem em locais distantes dos centros de diagnóstico. A competição com a flora cadavérica das carcaças de roedores e procedimentos inadequados de conservação e transporte das amostras aos laboratórios pode resultar na morte do bacilo e resultados falso-negativos. As técnicas moleculares apresentam-se como alternativas para estas situações, particularmente técnicas baseadas em PCR. No presente trabalho foi otimizada para o diagnóstico da peste a técnica N-PCRTbU que se baseia na separação física dos primers por imobilização dos primers internos na tampa do microtubo, dispensando a abertura do mesmo entre as duas etapas de amplificação, o que reduz a possibilidade de falsopositivos pela contaminação cruzada durante a manipulação dos amplicons no Nested-PCR convencional. Dois pares de primers, dirigidos ao gene estrutural (caf1) do antígeno F1 de Y. pestis (um par com homologia a uma região mais externa ao alvo e outro com homologia a uma região mais interna), foram inicialmente testados individualmente por PCR e depois por N-PCR tendo sido obtidos segmentos de tamanho esperado. Foram estabelecidas as concentrações de Taq DNA polimerase, dNTPs e MgCl2, bem como a proporção entre os primers externos e internos para o N-PCRTbU. Nos ensaios para estabelecimento do limiar de detecção a partir de DNA total e da cultura da cepa Y. pestis P. PB 881 a N-PCRTbU foi capaz de detectar respectivamente 10 pg de DNA e 20 bactérias viáveis. Baços de camundongos "Swiss Webster" infectados experimentalmente com a cepa Y. pestis P. PB 881 e amostras de baço, fígado, pulmão e coração conservadas no meio de Cary-Blair por 11 meses foram analisadas em paralelo por cultivo em gelose peptonada e pela técnica NPCRTbU. O fragmento de tamanho esperado (460pb) foi amplificado em todas as amostras mesmo nas que se revelaram multicontaminadas ou negativas pela cultura. Nos ensaios com DNA de outras espécies do gênero Yersinia: Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica e com baços de camundongos não infectados com a Y. pestis não houve amplificação. Além da especificidade e sensibilidade, como os resultados podem ser obtidos rapidamente, em menos de 24 horas, a N-PCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais [...]

Investigation of Yersinia pestis in Xenopsylla astia.

In this study, at the Department of Parasitology in the Pasteur Institute of Iran, Xenopsylla were allowed to feed on mice infected with Yersinia pestis. After 24-48 hours, they were killed by ether and kept in alcohol (70%) for 20 minutes. They were then examined for pathological signs and bacilli in different tissues and organs, longitudinally and cross-sectionally. The samples were studied using conjugated antibody and fluorescence microscopy. The results of this study revealed that the bacilli are abundant in the proventriculus after 6 hours, but it was found in other organs, rarely.

Study of suspected plague cases for isolation and identification of Yersinia pestis.

A total of 62 suspected patients of plague were investigated for evidence of Yersinia pestis, by blood culture, lymph node aspirate culture, sputum culture, animal inoculation and serology for f1 antibodies against f1 antigen of Yersinia pestis. None of the samples was positive by direct smear examination and culture for Yersinia pestis, as well as for serology. The non positivity of the cultures is discussed.

A simple PCR-based procedure for plague diagnosis

Triturados de bacos de animais infectados experimentalmente com Y. pestis, suspensos em salina foram fervidos e os sobrenadantes usados diretamente para amplificacao do PCR sem previa extracao do DNA. O limiar de deteccao pode ser aumentado por uma segunda etapa de amplificacao (Nested-PCR). Nao houve infectados usados como controle

Plague surveillance in Brazil: 1983-1992

A peste, infeccao pela Yersinia pestis, se mantem no Brasil, em varios focos naturais, disseminados na area rural, dos Estados do Ceara, Paraiba, Pernambuco, Piaui, Rio Grande do Norte, Alagoas, Bahia, Minas Gerais e Rio de Janeiro. Desde de 1983, o teste de hemaglutinacao passiva para anticorpos contra a fracao antigenica "F1A" de Y. pestis, vem sendo empregado ininterruptamente na vigilancia da peste nos focos brasileiros. A especificidade do PHA e controlada pelo teste de inibicao da aglutinacao. No periodo de 1983 a 1992 foram examinadas 220.769 amostras de soro, sendo 2.856 de origem humana, 49.848 de roedores pertencentes a 24 especies e de 2 especies de pequenos carnivoros selvagens (marsupiais), 122.890 soros de caes e 45.175 de gatos. Anticorpos especificos foram encontrados em 92 (3,22 por cento) dos soros humanos; 143 (0,29 por cento) soros de roedores de 8 especies e das duas especies de marsupiais, 1.105 (0,90 por cento) soros de caes e 290 (0,64 por cento) soros de gatos...

Survey of the irp2 gene among Yersinia pestis strains isolated during several plague outbreaks in northeast Brazil

The irp2 gene codes for a 190 kDa protein (HMWP2) synthesidez when highly pathogenic Yersinia are grown under conditions of iron starvation. In this work, the presence of irp2 in strains of Y. pestis isolated from different hosts during several plague outbreaks in the foci of Northeast Brazil wasstudied. For this purpose, 53 strains were spotted onto nylon filters and their DNA was hybridized with the A13 probe which is a 1 kb fragment of the irp2 coding sequence. All strains except two hybridized with the probe. However, when the initial stock culture of these two strains were analyzed, they both proved to bepositive with the A13 probe, indicating that the locus was lost after subculturein vitro but was always present in vivo. To examine the degree of conservation of the chromosomal fragment carrying irp2 among Brazilian strains, the hybridization profiles of 15 strains from different outbreaks, different hosts and different foci were compared. The hybridization profiles of these strains were all identical when their DNA was digested with either EcoRI, EcorRV or AvaII, indicatingthat the restriction sites surrounding the irp2 locus are very well conserved among Northeast Brazilian strains of Y. pestis. Altogether, these results suggest that the irp2 chromosomal region should be of prime importance for the bacteria during their multiplication in the host

Evaluation of three serological tests for the detection of human plague in northeast Brazil

The passive haemagglutination (PHA) test, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the dot enzyme-immunosorbent assay (DOT-ELISA) were used to detect the levels of IgG antibodies against the Fraction 1 (F1) antigen of Yersinia pestis in sera of plague-infected patients from Northeast Brazil. Twenty three selected PHA-positive sera of subjects with bacteriological confirmation of plague were also positive in the DOT-ELISA but only 19 were detected by the conventional ELISA technique. Another group of 186 serum samples from subjects diagnosed as plague-infected by clinical and epidemiological parameters, but PHA-negative, were screened with DOT-ELISA and 11 gave positive results. The specificity of the assays on the serological detection of plague was confirmed in inhibition tests using purified F1 antigen. These results suggest that DOT-ELISA can be an useful, simple and more sensitive alternative for the serodiagnosis of plague in Northeast Brazil

Strain specific variation of outer membrane proteins of wild Yersinia pestis strains subjected to different growth temperatures

Three Yersinia pestis strains isolated from humans and one laboratory strain (EV76) were grown in rich media at 28§C and 37§C and their outer membrane protein composition compared by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-Page). Several proteins with molecular weights ranging from 34 kDa to 7 kDa were observed to change in relative abundance in samples grown at different temperatures. At least seven Y. pestis outer membrane proteins showed a temperature-dependent and strain-specific behaviour. Some differences between the outer membrane proteins of full-pathogenic wild isolates and the EV76 strain could aldso be detected and the relevance of this finding on the use of laboratory strains as a reference to the study of Y. pestis biological properties is discuted

Pesquisa da infecçäo natural por Yersinia pestis, em pulicídeos provenientes de focos pestosos do nordeste do Brasil / Natural infection by Yersinia pestis, in fleas from plague foci in the northeast of Brasil

Foram avaliados três processos de acondicionamento e transporte de pulgas, objetivando análise bacteriológica para isolamento da Yearsinia pestis. As três abordagens testadas foram: pulgas vivas em tubos de ensaio com tiras dobradas de papel de filtro; pulgas em soluçäo salina; macerados de pulgas em meio de Cary-Blair. Os dois últimos métodos foram quase iguais e superiores ao primeiro. Foram analisadas pelas três técnicas, um total de 29.512 "pools" de pulicídeos provenientes de focos de peste do Nordeste do Brasil no período de 1966 a 1982. Deste total, 236 (0,80%) dos "pools" foram positivos por cultura e/ou inoculaçäo em animais sensíveis

Emprego do teste de imunofluorescência no diagnóstico da peste (infecçäo pela Yersinia Pestis) nos focos do nordeste do Brasil / Use of immunofluorescent antibody test in the plague diagnosis in the foci of the Brazil

Para avaliar a importância do emprego do teste de IMF na metodologia das atividades de vigilância e controle da peste nos focos brasileiros, foram realizados estudos com 10 macerados de "pools" de pulgas infectadas experimentalmente pela Yersinia pestis, 10 amostras de macerados de baços de roedores naturalmente infectados e 50 amostras de suco bubonático de pacientes, obtidos durante um surto de peste no Estado da Paraíba, em 1986. Os resultados das análises mostraram que o teste de IMF é inadequado para a detecçäo da Y. pestis em maceradores, entretanto apresenta interesse no diagnóstico da peste em material humano e de roedores, particularmente no caso de amostras contaminadas ou quando as bactérias tenham perdido a viabilidade

Plasmid composition and virulence-associated factors of Yersinia pestis isolates from a plague outbreak at the Paraiba Stae, Brazil

Cepas patogênicas de Yersinia pestis foram coletadas durante um surto de peste no Estado da Paraíba em 1986. Os isolados de Y. pestis foram analisados quanto a presença de fatores associados à virulência e conteúdo plasmidial. Todas as linhagens analisadas foram proficientes na expressäo dos antígenos VW e fraçäo 1, além de possuírem capacidade de adsorçäo de pigmentos e produçäo de pesticina-fibronolisina-coagulase. Um perfil plasmidial semelhante composto por quatro plasmídeos com peso molecular de 60, 44, 14.9, e 6.4 MD foi encontrado em todas as linhagens. A clivagem do DNA plasmidial com a enzima de restriçäo EcoRI demonstrou o conteúdo plasmidial uniforme dos isolados de Y. pestis. Sete outras linhagens de Y. pestis, isoladas previamente no mesmo local mas em condiçäo endêmica, mostraram o mesmo perfil plasmidial. A falta de diferenças entre os isolados epidêmicos e endêmicos assim como o uso do perfil plasmidial na epidemiologia de Y. pestis é discutida

Estudos bacteriológicos e sorológicos de um surto de peste no Estado da Paraíba, Brasil / Bacteriological and serological studies of a plague outbreak in the Paraíba state, Brazil

Foram realizados estudos bacteriológicos e/ou sorológicos para diagnóstico da infecçäo pestosa, em material obtido de 452 pacientes (48 positivos), 1.938 roedores e outros pequenos mamíferos (75 positivos), 4.756 cäes (141 positivos) e 3.047 gatos (57 positivos), oriundos de 41 municípios localizados em toda a extensäo da área paraibana do Planalto da Borborema. A infecçäo foi encontrada em 21 municípios. Foram isoladas 20 cepas de Yersinia pestis de amostras coletadas de três pacientes e 17 roedores. Estas cepas apresentam características bioquímicas, fatores de virulência, sensibilidade aos antibióticos e poder patogênico experimental semelhantes ao de cepas isoladas anteriormente. Pelos estudos realizados näo foram observados, no surto de peste que eclodiu em setembro de 1986 na Paraíba, fatores diferentes dos observados nos outros focos do nordeste do Brasil

Pesquisa de Yersinia pestis em roedores e outros pequenos mamíferos nos focos pestosos do nordeste do Brasil no período 1966 a 1982 / Detection of Yersinia pestis in rodents and other small mammals in the northeast of Brazil during the period from 1966 to 1982

Foi feita análise da metodologia empregada e dos resultados alcançados em pesquisa de Yersinia pestis, em material de 24.703 roedores e outros pequenos mamíferos oriundos dos focos pestosos do Nordeste do Brasil, no período de 1966 a 1982. Concluiu-se ser necessário haver maior rapidez na realizaçäo dos exames para que os dados obtidos sejam convenientemente aplicados nas atividades de vigilância e controle da peste

Estudo do roedor Akodon arviculoides, Wagner, 1842 (Cricetidae): importância nos focos pestosos no Brasil / The rodent Akodon arviculoides, Wagner, 1842 (Cricetidae): importance in plague focus of Brazil

Relata-se a ocorrência do roedor Akodon arviculoides (Wagner, 1842) no foco pestoso do Agreste pernambucano, sua capacidade de sobrevivência, reproduçäo e o desenvolvimento no cativeiro, a susceptibilidade à infecçäo pela Yersinia pestis e a importância desse roedor nos focos pestosos do Brasil

Demonstraçäo de atividade pestosa no foco da Serra dos Orgäos (Rio de Janeiro, Brasil) no período de 1983 a 1984, através de exames sorológicos em roedores / Detection of plague activity in the focus of the Serra dos Orgäos (Rio de Janeiro, Brazil) by serological examination of rodents during the period from 1983 to 1984

No período de 1983 a 1984 foram encontrados no foco pestoso da Serra dos Orgäos (Rio de Janeiro, Brasil) 6 roedores com títulos de anticorpos hemaglutinantes contra a fraçäo antigênica 1A da Yersinia pestis, >=1/16. A pesquisa do bacilo nos roedores e pulicídeos desse foco é recomendável