Pro-inflammatory response ensured by LPS and Pam3CSK4 in RAW 264.7 cells did not improve a fungistatic effect on Cryptococcus gattii infection.

BACKGROUND: The macrophage lineage is characterized by plasticity due to the acquisition of distinct functional phenotypes, and two major subsets are evaluated; classical M1 activation (strong microbicidal activity) and alternative M2 activation (immunoregulatory functions). The M1 subset expresses inducible nitric oxide synthase (iNOS), which is a primary marker to identify these cells, whereas M2 macrophages are characterized by expression of Arginase-1, found in inflammatory zone 1 (Fizz1), chitinase-like molecule (Ym-1), and CD206. The micro-environmental stimuli and signals in tissues are critical in the macrophage polarization. Toll-like receptors (TLR) ligands, such as lipopolysaccharide (LPS), palmitoyl-3-cysteine-serine-lysine-4 (Pam3CSK4), and ArtinM (mannose-binding lectin) are inductors of M1 subset. The impact of TLR2 and TLR4 signals to fight against Cryptococcus gattii infection is unknown, which is a fungal pathogen that preferentially infects the lung of immunocompetent individuals. The macrophages initiate an immune response to combat the C. gattii, then we evaluated in RAW 264.7 cell the effect of TLR2 and TLR4 agonists on the macrophage polarization dynamic and the impact on the growth of C. gattii. METHODS AND RESULTS: We demonstrated that P3C4, LPS, and ArtinM induced an increase in the levels of iNOS transcripts in RAW 264.7 cells, whereas the relative expression of arginase-1, Ym-1, and Fizz1 was significantly increased in the presence of IL-4 alone. The effects of TLR2 and TLR4 agonists on repolarization from the M2 to M1 subset was evaluated, and the first stimulus was composed of IL-4 and, after 24 h of incubation, the cells were submitted to a second stimulus of P3C4, LPS, ArtinM, or Medium. These TLR agonists induced the production of TNF-α in polarized RAW 264.7 cells to the M2 subset, moreover the measurement of M1/M2 markers using qRT-PCR demonstrated that a second stimulus with LPS for 24 h induced a significant augmentation of levels of iNOS mRNA. This impact of TLR2 and TLR4 agonists in the activation of the RAW 264.7 macrophage was assayed in the presence of C. gattii, the macrophages stimulated with TLR2 and TLR4 agonists for 24 h and co-cultured with C. gattii, as a second stimulus, reached high levels of TNF-α even after incubation with different concentrations of C. gattii. The activation of RAW 264.7 cells induced by TLR2 and TLR4 agonists favored the phagocytosis of C. gattii and inhibited the growth of yeast in the early period of infection. However, RAW 264.7 cells incubated with C. gattii in the presence of TLR2 and TLR4 agonists did not result a significant difference in the colony forming unit (CFU) assay in the early period of C. gattii infection, compared to negative control. CONCLUSION: Polarized RAW 264.7 cells to the M1 subset with TLR2 and TLR4 agonists did not inhibit the growth of C. gattii, whereas robust immunity was identified that could dysregulate host tolerance to this pathogen.

Avaliação do Teste de Ativação de Monócitos (MAT) para a detecção de pirógenos em Vacina Zika Inativada experimental

As vacinas, bem como todas as formulações injetáveis para uso humano, devem ser seguras e livres de pirogênio. Os pirógenos podem ser descritos como substâncias que, quando reconhecidas pelo sistema imune inato, desencadeiam respostas inflamatórias que resultam na liberação de citocinas, como IL-1ß e IL-6, e podem ocasionar diversos sintomas, entre eles a febre. Com o intuito de substituir o uso de coelhos, esse estudo buscou verificar a eficiência do Teste de Ativação de Monócitos (MAT) para sua validação analítica na detecção de pirógenos, lipopolissacarídeos (LPS) e ácido lipoteicóico (LTA), no concentrado da Vacina Zika Inativada através da quantificação do mediador inflamatório IL-1ß. Para isso, foi utilizado o PyroDetect System (Merck Millipore), seguindo as orientações do fabricante. O concentrado da vacina Zika foi testado puro e em diluições de 1/10, 1/20 e 1/40, com e sem a contaminação por LPS ou LTA. As amostras foram incubadas com sangue humano criopreservado (Cryoblood® – Kit PyroDetect) por 16-18h a 37oC e, em seguida, foi realizado um ensaio de ELISA para quantificar os níveis de IL-1ß liberados no sobrenadante. Os resultados dos testes indicaram baixos níveis de detecção de IL-1ß nas diluições testadas, inclusive nas amostras que foram contaminadas por endotoxina. Esses resultados sugerem que a vacina Zika possa ter algum componente que cause interferência no teste. Além disso, verificou-se menor liberação de IL-1ß nos ensaios do que o esperado, o que poderia levar a resultados superestimados da concentração de endotoxina nas amostras. Para determinar a exatidão do teste, foram calculadas as taxas de recuperação de endotoxina para cada ensaio, e estas deveriam estar em uma faixa entre 80 e 120% para a validação. No entanto, os resultados demonstraram taxas de recuperação fora da faixa esperada. Sendo assim, concluímos que os parâmetros de exatidão, precisão e reprodutibilidade não foram atingidos para a Vacina Zika nas condições testadas.

Avaliação do Teste de Ativação de Monócitos (MAT) para a detecção de pirógenos em Vacina Zika Inativada experimental

Injectable products including vaccines must be safe and pyrogen free. Pyrogens are molecules that once recognized by immune system can result in inflammatory responses of IL-1β e IL-6 cytokines release, leading to fever. In order to reduce number of laboratory animals, this study aimed to evaluate Monocyte Activation Test (MAT) efficiency at pyrogen detection in Zika Vaccine. The test was performed with PyroDetect System Merck Millipore, according supplier instructions. Zika vaccine was tested pure and diluted at 1/10, 1/20 and 1/40. Pyrogen recovery was tested by using spiked and non-spiked samples. After incubation with human cryopreserved blood Cryoblood® 16-18h, 37°C and CO2 5%, the incubation mixture blood and samples was collected to quantify IL-1β levels by ELISA. The results indicate low cytokine levels at tested samples, including spiked samples. This suggests vaccine had some interferers that might hinder the monocytes response. Furthermore, standard curves resulted lower absorbance values than expected, which would lead to misestimated endotoxin concentration in the samples. To assess test accuracy the calculated endotoxin recovery must be between 80 and 120% of spiked endotoxin. The results demonstrated variable recovery to same endotoxin concentration. We concluded this test seemed instable and it did not comply with accuracy and reproducibility parameters, for Zika Vaccine in the tested condition.

As vacinas, bem como todas as formulações injetáveis para uso humano, devem ser seguras e livres de pirogênio. Os pirógenos podem ser descritos como substâncias que, quando reconhecidas pelo sistema imune inato, desencadeiam respostas inflamatórias que resultam na liberação de citocinas, como IL-1β e IL-6, e podem ocasionar diversos sintomas, entre eles a febre. Com o intuito de substituir o uso de coelhos, esse estudo buscou verificar a eficiência do Teste de Ativação de Monócitos (MAT) para sua validação analítica na detecção de pirógenos, lipopolissacarídeos (LPS) e ácido lipoteicóico (LTA), no concentrado da Vacina Zika Inativada através da quantificação do mediador inflamatório IL-1β. Para isso, foi utilizado o PyroDetect System Merck Millipore, seguindo as orientações do fabricante. O concentrado da vacina Zika foi testado puro e em diluições de 1/10, 1/20 e 1/40, com e sem a contaminação por LPS ou LTA. As amostras foram incubadas com sangue humano criopreservado Cryoblood® – Kit PyroDetect por 16-18h a 37oC e, em seguida, foi realizado um ensaio de ELISA para quantificar os níveis de IL-1β liberados no sobrenadante. Os resultados dos testes indicaram baixos níveis de detecção de IL-1β nas diluições testadas, inclusive nas amostras que foram contaminadas por endotoxina. Esses resultados sugerem que a vacina Zika possa ter algum componente que cause interferência no teste. Além disso, verificou-se menor liberação de IL-1β nos ensaios do que o esperado, o que poderia levar a resultados superestimados da concentração de endotoxina nas amostras. Para determinar a exatidão do teste, foram calculadas as taxas de recuperação de endotoxina para cada ensaio, e estas deveriam estar em uma faixa entre 80 e 120% para a validação. No entanto, os resultados demonstraram taxas de recuperação fora da faixa esperada. Sendo assim, concluímos que os parâmetros de exatidão, precisão e reprodutibilidade não foram atingidos para a Vacina Zika nas condições testadas.