Description of ultrastructural damages in frozen-thawed canine spermatozoa / Descrição de danos ultraestruturais em espermatozoides caninos congelados-descongelados

In spite of the advances in transmission electronic microscopy (TEM), there are few studies presenting a systematic description of the canine spermatozoa and they are only focused on sperm cell heads. The goal of the present study was to describe ultrastructural appearance of canine fresh and frozen-thawed spermatozoa, focusing on damages induced by freezing-thawing in different sperm regions. Ten ejaculates from five proven stud dogs (two ejaculates/dog) were collected, evaluated, extended in Tris-egg yolk-glycerol, frozen and stored in liquid nitrogen, and thawed six weeks later.  Samples were evaluated for progressive motility, morphology, and for ultrastructural analysis by TEM. Concerning to TEM, the most striking differences between fresh and frozen-thawed samples were observed over the mid-piece since the fresh spermatozoa showed a well preserved mid-piece. However, the frozen-thawed spermatozoa mid-piece showed signs of damage such as mitochondrial vacuolization. In conclusion, freezing-thawing processes using a Tris-egg yolk extender induce ultrastructural damages in head and mid-piece of canine sperm, affecting the mitochondrial ultrastructure besides.KEY WORDS: Cryopreservation, dog, semen, ultrastructure.

Apesar dos avanços na microscopia eletrônica de transmissão (MET), existem poucos estudos apresentando uma descrição sistemática do espermatozoide canino, os quais estão focados apenas na cabeça espermática. Objetivou-se, com o presente estudo, descrever a aparência ultraestrutural do espermatozoide canino fresco e congelado-descongelado, enfocando os danos induzidos pela congelação e descongelação em diferentes regiões espermáticas. Dez ejaculados obtidos de cinco cães (dois ejaculados por cão) foram coletados, avaliados e diluídos em Tris-gema-glicerol, congelados e armazenados em nitrogênio líquido, e descongelados seis semanas após. Avaliaram-se as amostras quanto à motilidade progressiva, morfologia espermática e análise ultraestrutural por MET. Em relação à MET, as principais diferenças entre o espermatozoide fresco e descongelado foram observadas na peça intermediária, visto que o espermatozoide fresco apresentava uma peça intermediária bem preservada. Entretanto, a peça intermediária dos espermatozoides descongelados mostrava sinais de danos como a vacuolização das mitocôndrias.  Em conclusão, os processos de congelação e descongelação utilizando o diluente Tris-gema induzem danos ultraestruturais na cabeça e peça intermediária de células espermáticas caninas, afetando, inclusive, a ultraestrutura das mitocôndrias. PALAVRAS-CHAVES: Cão, criopreservação, sêmen, ultraestr

DESCRIPTION OF ULTRASTRUCTURAL DAMAGES IN FROZEN-THAWED CANINE SPERMATOZOA / DESCRIÇÃO DE DANOS ULTRAESTRUTURAIS EM ESPERMATOZOIDES CANINOS CONGELADOS-DESCONGELADOS

In spite of the advances in transmission electronic microscopy (TEM), there are few studies presenting a systematic description of the canine spermatozoa and they are only focused on sperm cell heads. The goal of the present study was to describe ultrastructural appearance of canine fresh and frozen-thawed spermatozoa, focusing on damages induced by freezing-thawing in different sperm regions. Ten ejaculates from five proven stud dogs (two ejaculates/dog) were collected, evaluated, extended in Tris-egg yolk-glycerol, frozen and stored in liquid nitrogen, and thawed six weeks later.  Samples were evaluated for progressive motility, morphology, and for ultrastructural analysis by TEM. Concerning to TEM, the most striking differences between fresh and frozen-thawed samples were observed over the mid-piece since the fresh spermatozoa showed a well preserved mid-piece. However, the frozen-thawed spermatozoa mid-piece showed signs of damage such as mitochondrial vacuolization. In conclusion, freezing-thawing processes using a Tris-egg yolk extender induce ultrastructural damages in head and mid-piece of canine sperm, affecting the mitochondrial ultrastructure besides.KEY WORDS: Cryopreservation, dog, semen, ultrastructure.

Apesar dos avanços na microscopia eletrônica de transmissão (MET), existem poucos estudos apresentando uma descrição sistemática do espermatozoide canino, os quais estão focados apenas na cabeça espermática. Objetivou-se, com o presente estudo, descrever a aparência ultraestrutural do espermatozoide canino fresco e congelado-descongelado, enfocando os danos induzidos pela congelação e descongelação em diferentes regiões espermáticas. Dez ejaculados obtidos de cinco cães (dois ejaculados por cão) foram coletados, avaliados e diluídos em Tris-gema-glicerol, congelados e armazenados em nitrogênio líquido, e descongelados seis semanas após. Avaliaram-se as amostras quanto à motilidade progressiva, morfologia espermática e análise ultraestrutural por MET. Em relação à MET, as principais diferenças entre o espermatozoide fresco e descongelado foram observadas na peça intermediária, visto que o espermatozoide fresco apresentava uma peça intermediária bem preservada. Entretanto, a peça intermediária dos espermatozoides descongelados mostrava sinais de danos como a vacuolização das mitocôndrias.  Em conclusão, os processos de congelação e descongelação utilizando o diluente Tris-gema induzem danos ultraestruturais na cabeça e peça intermediária de células espermáticas caninas, afetando, inclusive, a ultraestrutura das mitocôndrias. PALAVRAS-CHAVES: Cão, criopreservação, sêmen, ultraestr

Comparison of two dilution rates on canine semen quality after cryopreservation in a coconut water extender.

The objective of the present study was to evaluate the effect of sperm dilution (one part semen:one part extender or at 200 x 10(6) spermatozoa/mL) using a coconut water extender on the post-thaw sperm quality. Twelve ejaculates were collected from six dogs. Semen was divided into two aliquots, one for dilution one part semen:one part extender (group 1) and another for a concentration of 200 x 10(6) spermatozoa/mL (group 2). Semen was initially extended at 37 degrees C at a proportion of one part semen:half part extender (1:1/2) for group 1 (A-fraction). For group 2, the volume for a concentration of 200 x 10(6) spermatozoa/mL was calculated and a half of this volume was used for the initial dilution (A-fraction, 37 degrees C). Coconut water extender containing 20% egg yolk was used for this initial dilution in both groups. After dilution, the semen was cooled for 40 min in a thermal box (15 degrees C) and for 30 min in a refrigerator. The other half of the extender (B-fraction) containing egg yolk and glycerol (12%) was added to semen in both groups. Subsequently, the final concentration of glycerol in the extender was 6%. Ejaculates were frozen in 0.25 mL straws 5 cm above the surface of liquid nitrogen and stored at -196 degrees C. After 1 week, straws were thawed at 37 degrees C for 1 min and the microscopic criteria were evaluated. The dilution method had no influence on sperm motility, vigor and normal spermatozoa (71.4 compared with 67.7%). There was no effect of dog, ejaculate within male on post-thaw semen quality. Moreover, there was not a male x treatment interaction. Both treatments were efficient in preserving sperm quality.

Criopreservação de sêmen canino com um diluidor à base de água de coco

The long-term storage of frozen semen represents a tool for breeders that want to preserve the genetic potential of their sires. The aim of this experiment was to evaluate the effect of coconut water, egg yolk and glycerol on canine semen cooling and freezing. The sperm rich fraction of 12 dogs was submitted to macroscopic and microscopic evaluation. This fraction was divided into four aliquots and frozen with coconut water extender regarding the presence of egg yolk and glycerol. After cooling, there was no difference among groups. However, after thawing, coconut water plus egg yolk and glycerol (ACGG) was superior than others concerning to sperm motility, vigor and morphological abnormalities. In this group, motility (%), vigor (0-5) and abnormalities (%) were 56.7 ± 16.1, 3.4 ± 0.5 e 23.8 ± 8.4, respectivelly. In conclusion, it is necessary to add egg yolk and glycerol to the coconut water extender to improve the cryopreservation of canine semen.

A estocagem do sêmen por um longo período, permitindo o seu posterior uso representa uma importante ferramenta para criadores que desejam resguardar o potencial genético de seus reprodutores. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da água de coco, gema de ovo e glicerol sobre o resfriamento e a criopreservação de sêmen canino. A fração espermática do ejaculado de 12 cães foi avaliada macro e microscopicamente e, em seguida, dividida em quatro alíquotas, submetidas à congelação em quatro diluidores, sendo todos à base água de coco e diferindo quanto à presença ou não da gema de ovo e glicerol. Durante o resfriamento, não se observou diferença entre os grupos, entretanto, após o congelamento e descongelamento, o diluidor adicionado de gema de ovo e glicerol (ACGG) foi superior aos demais quanto à motilidade, vigor e morfologia espermática. Nesse grupo, os valores de motilidade (%), vigor (0-5) e alterações morfológicas totais (%) após a descongelação foram 56,7 ± 16,1, 3,4 ± 0,5 e 23,8 ± 8,4, respectivamente. Diante dos resultados, concluiu-se que a adição de gema de ovo e glicerol ao diluidor foi necessária para a preservação da qualidade espermática após criopreservação de sêmen canino.

CONSERVAÇÃO DO SÊMEN CANINO A 37ºC EM DILUENTES À BASE DE ÁGUA DE COCO

The aim of this study was to evaluate the canine semen diluted with coconut water extender, added of 3-indol acetic acid (IAA) and egg yolk at 37ºC. Sperm of six stud dogs was collected by digital manipulation and divided in three equal aliquots. Dilution was performed by the addiction of coconut water (extender 1), coconut water plus 4% of IAA (extender 2) and coconut water plus 4% of IAA and 20% of egg yolk (extender 3). Sperm motility, vigor and morphology immediately after dilution and periodically until 180 minutes, as well as media degradation motility rate (DMR), were evaluated. Extenders were compared by Whitney-Mann test (P 0.05). Statistical differences were not shown between the extenders up to 60 minutes. After 90 minutes, sperm motility on the extender A was superior to the other extenders (95%). The DMR on the extender A (7.5%) was significantly inferior to the other extenders. Thus, coconut water extender is adequate for the preservation of canine semen at 37ºC for 180 minutes.

O presente trabalho objetivou avaliar a eficiência do diluidor à base de água de coco acrescido de ácido 3-indol acético (AIA) e gema de ovo na conservação do sêmen canino a 37ºC. Coletou-se o sêmen de seis cães adultos por manipulação digital, fracionando-o em três alíquotas. Procedeu-se a diluição do sêmen com o diluidor à base de água de coco (grupo A), com este acrescido de 4% de AIA (grupo B) e, com o mesmo acrescido de 20% de gema de ovo e 4%AIA (grupo C). Avaliou-se a motilidade, o vigor e a percentagem de alterações morfológicas espermáticas imediatamente após a coleta e periodicamente durante 180 minutos (T0, T5, T15, T30, T60, T90, T120, T180), avaliando-se também a taxa de degradação média de motilidade espermática (TDM). Os diluidores foram comparados pelo teste de Whitney-Mann (P 0,05). Não foram verificadas diferenças estatísticas entre os grupos até T60. A motilidade no uso do grupo A foi superior à dos demais grupos a partir de T90, ficando em torno de 95%.A TDM foi significativamente menor no diluente A (7,5%) em relação aos demais diluentes. Dessa forma, o diluente à base de água de coco mostrou-se adequado para a preservação do sêmen canino a 37ºC por 180 minutos.

Conservação do sêmen canino a 37ºc em diluentes à base de água de coco

The aim of this study was to evaluate the canine semen diluted with coconut water extender, added of 3-indol acetic acid (IAA) and egg yolk at 37ºC. Sperm of six stud dogs was collected by digital manipulation and divided in three equal aliquots. Dilution was performed by the addiction of coconut water (extender 1), coconut water plus 4% of IAA (extender 2) and coconut water plus 4% of IAA and 20% of egg yolk (extender 3). Sperm motility, vigor and morphology immediately after dilution and periodically until 180 minutes, as well as media degradation motility rate (DMR), were evaluated. Extenders were compared by Whitney-Mann test (P 0.05). Statistical differences were not shown between the extenders up to 60 minutes. After 90 minutes, sperm motility on the extender A was superior to the other extenders (95%). The DMR on the extender A (7.5%) was significantly inferior to the other extenders. Thus, coconut water extender is adequate for the preservation of canine semen at 37ºC for 180 minutes.

O presente trabalho objetivou avaliar a eficiência do diluidor à base de água de coco acrescido de ácido 3-indol acético (AIA) e gema de ovo na conservação do sêmen canino a 37ºC. Coletou-se o sêmen de seis cães adultos por manipulação digital, fracionando-o em três alíquotas. Procedeu-se a diluição do sêmen com o diluidor à base de água de coco (grupo A), com este acrescido de 4% de AIA (grupo B) e, com o mesmo acrescido de 20% de gema de ovo e 4%AIA (grupo C). Avaliou-se a motilidade, o vigor e a percentagem de alterações morfológicas espermáticas imediatamente após a coleta e periodicamente durante 180 minutos (T0, T5, T15, T30, T60, T90, T120, T180), avaliando-se também a taxa de degradação média de motilidade espermática (TDM). Os diluidores foram comparados pelo teste de Whitney-Mann (P 0,05). Não foram verificadas diferenças estatísticas entre os grupos até T60. A motilidade no uso do grupo A foi superior à dos demais grupos a partir de T90, ficando em torno de 95%.A TDM foi significativamente menor no diluente A (7,5%) em relação aos demais diluentes. Dessa forma, o diluente à base de água de coco mostrou-se adequado para a preservação do sêmen canino a 37ºC por 180 minutos.

Criopreservação de sêmen canino com um diluidor à base de água de coco

The long-term storage of frozen semen represents a tool for breeders that want to preserve the genetic potential of their sires. The aim of this experiment was to evaluate the effect of coconut water, egg yolk and glycerol on canine semen cooling and freezing. The sperm rich fraction of 12 dogs was submitted to macroscopic and microscopic evaluation. This fraction was divided into four aliquots and frozen with coconut water extender regarding the presence of egg yolk and glycerol. After cooling, there was no difference among groups. However, after thawing, coconut water plus egg yolk and glycerol (ACGG) was superior than others concerning to sperm motility, vigor and morphological abnormalities. In this group, motility (%), vigor (0-5) and abnormalities (%) were 56.7 ± 16.1, 3.4 ± 0.5 e 23.8 ± 8.4, respectivelly. In conclusion, it is necessary to add egg yolk and glycerol to the coconut water extender to improve the cryopreservation of canine semen.

A estocagem do sêmen por um longo período, permitindo o seu posterior uso representa uma importante ferramenta para criadores que desejam resguardar o potencial genético de seus reprodutores. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da água de coco, gema de ovo e glicerol sobre o resfriamento e a criopreservação de sêmen canino. A fração espermática do ejaculado de 12 cães foi avaliada macro e microscopicamente e, em seguida, dividida em quatro alíquotas, submetidas à congelação em quatro diluidores, sendo todos à base água de coco e diferindo quanto à presença ou não da gema de ovo e glicerol. Durante o resfriamento, não se observou diferença entre os grupos, entretanto, após o congelamento e descongelamento, o diluidor adicionado de gema de ovo e glicerol (ACGG) foi superior aos demais quanto à motilidade, vigor e morfologia espermática. Nesse grupo, os valores de motilidade (%), vigor (0-5) e alterações morfológicas totais (%) após a descongelação foram 56,7 ± 16,1, 3,4 ± 0,5 e 23,8 ± 8,4, respectivamente. Diante dos resultados, concluiu-se que a adição de gema de ovo e glicerol ao diluidor foi necessária para a preservação da qualidade espermática após criopreservação de sêmen canino.

Congelação de sêmem canino com diferentes concentrações de gema de ovo e glicerol em diluidores à base de tris e água de coco

The aim of the present research was to compare the efficiency of coconut water and Tris extenders on canine semen freezing. The semen from 5 German Shepherd dogs was collected by digital manipulation. The spermatic fraction of different dogs was evaluated about its macro and microscopic parameters and mixed in a pool. It was extended in coconut water or Tris, added of egg yolk (10 or 20%) and glycerol (4, 6 or 8%). Then, it was frozen by the method of NUNES et al. (1997) and thawed at 37ºC after one week. A Tris extender superiority was shown at the conservation of vigor (2.3 ± 0.8), total (14.8 ± 5.1%) and secondary (14.4 ± 5.5%) spermatic defects in the protocols with 20% of egg yolk and 6% of glycerol. In all other protocols, there were no significant differences for the observed parameters. These results suggest a superiority of Tris extender over the coconut water extender on canine semen freeze, in the use of them added of 20% of egg yolk and 6% of glycerol.

O objetivo do presente trabalho foi comparar os diluidores à base de água de coco e à base de Tris na congelação do sêmen canino, utilizando-se diferentes concentrações de gema de ovo e glicerol. Cães Pastores Alemães (n=5) tiveram seu sêmen coletado por manipulação digital. Sua fração espermática foi avaliada quanto aos parâmetros macro e microscópicos e misturada para a formação de um pool de esperma que foi diluído em água de coco ou Tris, acrescidos de gema de ovo (10 ou 20%) e glicerol (4, 6 ou 8%). Em seguida, congelado pelo método de NUNES et al. (1997), sendo descongelado a 37ºC após uma semana. Observou-se uma superioridade do diluidor à base de Tris na conservação dos parâmetros vigor (2,3 ± 0,8), alterações espermáticas totais (14,8 ± 5,1%) e secundárias (14,4 ± 5,5%) no par onde os diluidores foram acrescidos de 20% de gema de ovo e 6% de glicerol. Nos demais protocolos, não se evidenciaram diferenças significativas entre os dois diluidores, em nenhum dos parâmetros observados. Esses resultados sugerem uma superioridade do diluidor à base de Tris em relação ao diluidor à base de água de coco na congelação do sêmen canino, no uso dos mesmos acrescidos de 20% de gema de ovo e 6% de glicerol.

Congelação de sêmem canino com diferentes concentrações de gema de ovo e glicerol em diluidores à base de tris e água de coco

The aim of the present research was to compare the efficiency of coconut water and Tris extenders on canine semen freezing. The semen from 5 German Shepherd dogs was collected by digital manipulation. The spermatic fraction of different dogs was evaluated about its macro and microscopic parameters and mixed in a pool. It was extended in coconut water or Tris, added of egg yolk (10 or 20%) and glycerol (4, 6 or 8%). Then, it was frozen by the method of NUNES et al. (1997) and thawed at 37ºC after one week. A Tris extender superiority was shown at the conservation of vigor (2.3 ± 0.8), total (14.8 ± 5.1%) and secondary (14.4 ± 5.5%) spermatic defects in the protocols with 20% of egg yolk and 6% of glycerol. In all other protocols, there were no significant differences for the observed parameters. These results suggest a superiority of Tris extender over the coconut water extender on canine semen freeze, in the use of them added of 20% of egg yolk and 6% of glycerol.

O objetivo do presente trabalho foi comparar os diluidores à base de água de coco e à base de Tris na congelação do sêmen canino, utilizando-se diferentes concentrações de gema de ovo e glicerol. Cães Pastores Alemães (n=5) tiveram seu sêmen coletado por manipulação digital. Sua fração espermática foi avaliada quanto aos parâmetros macro e microscópicos e misturada para a formação de um pool de esperma que foi diluído em água de coco ou Tris, acrescidos de gema de ovo (10 ou 20%) e glicerol (4, 6 ou 8%). Em seguida, congelado pelo método de NUNES et al. (1997), sendo descongelado a 37ºC após uma semana. Observou-se uma superioridade do diluidor à base de Tris na conservação dos parâmetros vigor (2,3 ± 0,8), alterações espermáticas totais (14,8 ± 5,1%) e secundárias (14,4 ± 5,5%) no par onde os diluidores foram acrescidos de 20% de gema de ovo e 6% de glicerol. Nos demais protocolos, não se evidenciaram diferenças significativas entre os dois diluidores, em nenhum dos parâmetros observados. Esses resultados sugerem uma superioridade do diluidor à base de Tris em relação ao diluidor à base de água de coco na congelação do sêmen canino, no uso dos mesmos acrescidos de 20% de gema de ovo e 6% de glicerol.