Perfil imuno-histoquímico de marcadores associados à transição epitelial-mesenquimal em lesões odontogênicas epiteliais benignas / Immunohistochemical profile of markers associated with epithelial-mesenchymal transition in benign epithelial odontogenic lesions

Os cistos e tumores odontogênicos, lesões que acometem o complexo maxilomandibular, podem exibir comportamento clínico-biológico mais agressivo. E a transição epitelialmesenquimal (TEM), processo pelo qual as células epiteliais perdem propriedades fenotípicas e adquirem características de células mesenquimais, incluindo maior motilidade e capacidade de invasão, através da regulação de fatores centrais de transcrição e suas vias associadas, podem fazer parte de características associadas às lesões odontogênicas. Dessa forma, o presente trabalho buscou analisar e comparar a expressão imuno-histoquímica de proteínas (Zeb1, Ecaderina, N-caderina e vimentina) envolvidas no processo de TEM, em lesões odontogênicas epiteliais benignas. A amostra consistiu em 88 casos de lesões odontogênicas, das quais compreendem 28 casos de ameloblastoma (AB), 30 de ceratocisto odontogênico (CO) e 30 de cisto dentígero (CD). Todos os espécimes submetidos à técnica imuno-histoquímica foram avaliados por microscopia de luz, e submetidos à escolha aleatória de 5 (cinco) campos, os quais foram fotografados em um aumento de 400x. A avaliação da expressão de cada marcador, a partir da análise em seu compartimento celular específico, foi feita de forma semiquantitativa, através da multiplicação dos escores associados à porcentagem de células imunomarcadas pelos escores relacionados à intensidade da coloração, sendo feita uma média dos cinco campos e o resultado definido como baixa expressão ou alta expressão, conforme metodologia utilizada. As associações foram feitas através do teste de Qui-quadrado e as correlações através do teste de correlação de Spearman. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05). Os resultados mostraram um pico de prevalência entre a 2ª e 3ª décadas de vida, em todas as lesões estudadas, com um acometimento maior em região posterior de mandíbula, e os ABs foram as lesões de maiores tamanhos, com 65% medindo acima de 2,5cm. A imuno-histoquímica evidenciou baixa expressão de Zeb1 em epitélio odontogênico das lesões estudadas, alta expressão de E-caderina e N-caderina, e uma expressão intermediária de vimentina. Quando realizada a correlação entre os marcadores, observou-se nos casos de AB uma correlação positiva e moderada entre Zeb1 nuclear e E-caderina membranar, Zeb1 citoplasmática e E-caderina membranar e entre E-caderina e vimentina citoplasmáticas. Como também uma correlação positiva moderada, nos casos de CD, entre Zeb1 nuclear e vimentina citoplasmática, e entre Zeb1 e vimentina citoplasmáticas. Logo, podemos concluir que Zeb1 pode estar atuando indiretamente nas vias responsáveis pelo crescimento e características morfológicas dessas lesões estudadas. Além disso, a expressão diferencial de E-caderina, Ncaderina e vimentina demonstraram fazer parte de um processo de TEM parcial nas lesões odontogênicas epiteliais benignas estudadas (AU).

Odontogenic cysts and tumors, lesions that affect the maxillomandibular complex, may exhibit a more aggressive clinical-biological behavior. And the epithelial-mesenchymal transition (EMT), a process by which epithelial cells lose phenotypic properties and acquire characteristics of mesenchymal cells, including increased motility and invasiveness, through the regulation of central transcription factors and their associated pathways, may be part of characteristics associated with odontogenic lesions. Thus, the present work sought to analyze and compare the immunohistochemical expression of proteins (Zeb1, E-cadherin, N-cadherin and vimentin) involved in the MET process in benign epithelial odontogenic lesions. The sample consisted of 88 cases of odontogenic lesions, comprising 28 cases of ameloblastoma (AB), 30 of odontogenic keratocyst (CO) and 30 of dentigerous cyst (CD). All specimens submitted to the immunohistochemical technique were evaluated by light microscopy and submitted to the random choice of 5 (five) fields, which were photographed at a magnification of 400x. The evaluation of the expression of each marker, based on the analysis in its specific cellular compartment, was carried out in a semi-quantitative manner, through the multiplication of the scores associated with the percentage of immunostained cells by the scores related to the intensity of staining, with an average of the five fields and the result defined as low expression or high expression, according to the methodology used. The associations were made using the chi-square test and the correlations using the Spearman correlation test. The significance level was set at 5% (p < 0.05). The results showed a prevalence peak between the 2nd and 3rd decades of life, in all the lesions studied, with a greater involvement in the posterior region of the mandible, and the ABs were the largest lesions, with 65% measuring above 2, 5cm. Immunohistochemistry showed low expression of Zeb1 in the odontogenic epithelium of the lesions studied, high expression of E-cadherin, high expression of N-cadherin and an intermediate expression of vimentin. When the correlation between the markers was performed, a positive and moderate correlation was observed in the cases of AB between nuclear Zeb1 and membrane E-cadherin, cytoplasmic Zeb1 and membrane E-cadherin and between cytoplasmic E-cadherin and vimentin. As well as a moderate positive correlation, in CD cases, between nuclear Zeb1 and cytoplasmic vimentin, and between cytoplasmic Zeb1 and vimentin. Therefore, we can conclude that Zeb1 may be acting indirectly on the pathways responsible for the growth and morphological characteristics of these lesions studied. Furthermore, the differential expression of E-cadherin, N-cadherin and vimentin was shown to be part of a partial TEM process in the benign epithelial odontogenic lesions studied (AU).

Imunoexpressão das proteínas e-caderina, snail1 e vimentina em neoplasias de glândula salivar / Immunoexpression of e-cadherin, snail1 and vimentin proteins in salivary gland neoplasms

Os tumores de glândula salivar (TGS) representam cerca de 3% a 6% das neoplasias da região de cabeça e pescoço e são caracterizados por sua diversidade morfológica e de comportamentos biológicos. Sabe-se que algumas das características de tumores malignos, como a invasão tumoral e metástases à distância, possuem envolvimento da transição epitélio-mesênquima (TEM), evento no qual proteínas como a E-caderina, Snail1 e Vimentina estão diretamente envolvidas. Esta pesquisa se propôs a analisar e relacionar a expressão imuno-histoquímica dessas proteínas com as características clínico-patológicas em adenomas pleomórficos (APs), carcinomas adenoides císticos (CACs) e carcinomas ex-adenomas pleomórficos (CaExAPs) de glândulas salivares maiores e menores. A análise da imunoexpressão dessas proteínas foi feita de forma semiquantitativa em 20 casos de APs, 20 de CACs e 10 de CaExAPs. Na avaliação de E-caderina, considerou-se a expressão em membrana e/ou citoplasma das células do parênquima tumoral. Para a Snail1, foi considerada a expressão nos compartimentos nuclear e/ou citoplasmático dessas células. A Vimentina foi analisada no citoplasma de células fusiformes presentes no estroma dos TGS. Os dados obtidos foram comparados e correlacionados utilizando o nível de significância de 5% (p ≤ 0,05). Observou-se imunopositividade para E-caderina principalmente em citoplasma das células neoplásicas nãoluminais; a marcação membranar, perceptível em células luminais, estava mais presente nas neoplasias malignas (p = 0,041). A expressão de Snail1 foi mais frequente no compartimento nuclear, sendo mais evidenciada em células não-luminais dos TGS e apresentou maior reatividade nuclear em tumores malignos (p = 0,012). A expressão nuclear dessa proteína também foi maior para CACs e CaExAPs ao compará-los, de forma separada, com os APs (p = 0,037 e p = 0,025, respectivamente). Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre a expressão de E-caderina e Snail1 e outros parâmetros clinico-patológicos e os subtipos histopatológicos das lesões (p > 0,05). A positividade para Vimentina foi vista no estroma de todos os casos de TGS, sendo mais difusa e intensa em CACs. Não foram verificadas diferenças estatisticamente significativas entre a expressão desse biomarcador e os parâmetros clínico-patológicos e subtipos histopatológicos das lesões (p > 0,05). Houve correlações positivas entre as expressões membranar e citoplasmática de E-caderina em APs, CACs e CaExAPs (r = 0,645, p = 0,002; r = 0,781, p < 0,001; r = 0,677 p = 0,031), bem como entre a expressão nuclear e citoplasmática de Snail1 e a expressão citoplasmática de E-caderina e nuclear de Snail1 em APs (r = 0,569, p = 0,009; r = 0,481, p = 0,032). Foram verificadas correlações negativas entre a expressão membranar de E-caderina e citoplasmática de Snail1, bem como entre Snail1 nuclear e Vimentina em CACs (r = -0,471, p = 0,036; r = -0,514; p = 0,021). Essa última correlação, bem como correlação positiva entre a expressão membranar e citoplasmática de E-caderina, também foi vista entre os casos de CACs e CaExAPs quando agrupados (r = -0,457; p = 0,0011; r = 0,746, p < 0,001). Os resultados do presente estudo sugerem que a participação de E-caderina e Snail1 no processo da TEM pode estar relacionada ao estágio de diferenciação celular em APs e à progressão tumoral nas neoplasias malignas bem como é possível que a expressão dessas proteínas em neoplasias malignas seja indicativa da plasticidade presente na TEM. Ressalta-se, também, a expressão de Vimentina em células fusiformes presentes no estroma tumoral, provavelmente refletindo estágios tardios da TEM (AU).

Salivary gland tumors (SGTs) comprise about 2% to 10% of head and neck tumors and are known for their morphologic diversity and biologic behavior. Some features of malignant neoplasms, such as tumor invasion and distant metastasis, might have the participation of epithelial-mesenchymal transition (EMT), event in which proteins like E-cadherin, Vimentin and Snail1 are directly involved. This study aimed to analyze, by means of immunohistochemistry, the expression of these proteins, as well as to relate their expressions to clinical-pathological features of pleomorphic adenomas (PAs), adenoid cystic carcinomas (ACCs) and carcinomas ex-pleomorphic adenomas (CXPAs) located in minor and major salivary glands. This was a semi-quantitatively analysis which comprised 20 PAs, 20 ACCs and 10 CXPAs. Analysis of E-cadherin was made considering membranar and/or cytoplasmatic expression in parenchymal cells. For Snail1, it was considered the positivity in nucleus and/or cytoplasm of parenchymal cells. Vimentin was evaluated in the cytoplasm of fusiform stromal cells. Data were compared and correlated adopting a level of significance of 5% (p ≤ 0,05). Marked immunoexpression for E-cadherin was mostly found in the cytoplasm of non-luminal neoplastic cells in SGTs; membrane reaction for the protein, seen in luminal cells, was higher in malignant tumors (p = 0,041). Snail1 was more expressed in the nucleus, mostly of nonluminal cells of SGTs, with this reactivity being higher in malignant tumors(p = 0,012). Nuclear positivity for this marker was also higher for ACCs and CXPAs when compared with PAs separately (p = 0,037 e p = 0,025, respectively). No significant differences between E-cadherin and Snail1 and other clinical-pathological parameters were found (p > 0,05). Vimentin was seen in the stroma of all cases, being more diffuse and intense in ACCs. No significant differences between this marker and clinical-pathological parameters were found (p > 0,05). Positive correlations between membranar and cytoplasmatic E-cadherin in PAs, ACCs and CXPAs were observed (r = 0,645, p = 0,002; r = 0,781, p < 0,001; r = 0,677 p = 0,031), as well as between nuclear and cytoplasmatic Snail1 and between cytoplasmatic E-cadherin and nuclear Snail1 in PAs APs (r = 0,569, p = 0,009; r = 0,481, p = 0,032). Negative correlations between membranar E-cadherin and cytoplasmatic Snail1 were observed, as well as between nuclear Snail1 and Vimentin in ACCs (r = -0,471, p = 0,036; r = -0,514; p = 0,021). This last correlation and a positive correlation between membranar and cytoplasmatic E-cadherin were also seen when ACCs and CXPAs were grouped (r = -0,457; p = 0,0011; r = 0,746, p < 0,001). These results suggest that the participation of these proteins in EMT might be related to cellular differentiation in PAs and to tumoral progression in malignant tumors. In addition, it can be infered that the expression of E-cadherin and Snail1 in malignant tumors might reflect the plasticity seen in EMT process. Furthermore, the expression of Vimentin in fusiform stromal cells, probably in later stages of EMT, in the stroma of SGTs, is highlighted (AU).

Imunoexpressão das proteínas E-caderina e Twist1 em neoplasias de glândulas salivares / Immunoexpression of E-cadherin and Twist1 proteins in salivary gland neoplasms

As neoplasias de glândulas salivares apresentam uma grande diversidade de aspectos morfológicos e comportamentos biológicos, trazendo dificuldades diagnósticas e suscitando interesse na pesquisa cientifica destas lesões. Por sua vez, é reconhecida a importância da transição epitelial-mesenquimal (TEM) a qual desempenha um papel fundamental na invasão e progressão tumoral sendo uma etapa necessária para a metástase. Nesse processo, as células epiteliais perdem sua adesão e polaridade e adquirem propriedades mesenquimais e aumento da motilidade, com diminuição da expressão de biomarcadores epiteliais e aumento da expressão de biomarcadores mesenquimais. Dentre os biomarcadores envolvidos nesse processo, estão a E-caderina e o Twist, que participam de maneira fundamental no processo da TEM. Diante disso, este estudo teve por objetivo investigar a imunoexpressão dessas proteínas em Adenoma Pleomórfico (AP), Carcinoma Adenoide Cístico (CAC) e Carcinoma Ex-Adenoma Pleomórfico (CaExAP) objetivando melhor compreensão do processo de TEM nesse grupo de lesões. O estudo foi descritivo e comparativo, observacional e de corte transversal e a amostra foi composta por 20 casos de AP, 20 de CAC e 10 de CaExAP, nos quais foram analisadas as imunoexpressões das proteínas no parênquima tumoral. Foram investigadas possíveis diferenças entre o padrão de expressão destas proteínas com o perfil clinicopatológico das lesões estudadas. Em relação à imunorreatividade para a E-caderina, foi observada marcação citoplasmática em 90% dos casos de AP, 95% para CAC e 80% para CaExAP; expressão membranar foi observada em 40%, 75% e 80% respectivamente. O Twist1 foi positivo em 80% dos casos de AP e em todos os casos das neoplasias malignas. Foi observada diferença estatisticamente significativa entre uma maior expressão da E-caderina membranar e a natureza benigna dos TGS estudados (p = 0,030), entretanto, as imunoexpressões citoplasmáticas da E-caderina e Twist1 não demonstraram resultados significativos quanto à natureza benigna/maligna das lesões (p > 0,05). Em relação aos padrões histopatológicos do AP e subtipos histológicos dos CAC, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre as imunoexpressões das proteínas estudadas, da mesma forma para a localização anatômica dos casos de nossa amostra (p > 0,05). Ao se avaliar possíveis diferenças entre a imunoexpressão das proteínas E-caderina (citoplasmática e membranar) e Twist1 com as características clínicas das neoplasias malignas (CAC e CaExAP), foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas entre uma maior expressão da E-caderina citoplasmática em tumores de maior tamanho T3/T4 (p = 0,024). A imunoexpressão membranar da E-caderina não demonstrou resultados estatisticamente significativos para nenhum dos parâmetros clínicos investigados nas neoplasias malignas incluídas no presente estudo (p > 0,05). Nossos resultados sugerem a participação dessas proteínas em neoplasias de glândulas salivares, além de que a alta expressão citoplasmática da E-caderina pode ser indicativa de tumores com pior comportamento clínico (AU).

Salivary gland neoplasms present a great diversity of morphological aspects and biological behaviors, bringing diagnostic difficulties and raising interest in the scientific research of these lesions. In turn, the importance of the epithelial-mesenchymal transition (EMT) is recognized, which plays a key role in tumor invasion and progression, being a necessary step for metastasis. In this process, epithelial cells lose their adhesion and polarity and acquire mesenchymal properties and increased motility, with decreased expression of epithelial biomarkers and increased expression of mesenchymal biomarkers. Among the biomarkers involved in this process are E-cadherin and Twist, which play a fundamental role in the EMT process. Therefore, this study aimed to investigate the immunoexpression of these proteins in Pleomorphic Adenoma (PA), Cystic Adenoid Carcinoma (ACC) and Carcinoma ExPleomorphic Adenoma (CXPA) aiming to better understand the EMT process in this group of lesions. The study was descriptive and comparative, observational and cross-sectional, and the sample consisted of 20 cases of PA, 20 of ACC and 10 of CXPA, in which the immunoexpression of proteins in the tumor parenchyma was analyzed. Possible differences between the expression pattern of these proteins and the clinicopathological profile of the studied lesions were investigated. Regarding immunoreactivity for E-cadherin, cytoplasmic labeling was observed in 90% of the cases of PA, 95% for ACC and 80% for CXPA; membrane expression was observed in 40%, 75% and 80% respectively. Twist1 was positive in 80% of cases of PA and in all cases of malignant neoplasms. A statistically significant difference was observed between a greater expression of membrane E-cadherin and the benign nature of the TGS studied (p = 0.030), however, the cytoplasmic immunoexpression of E-cadherin and Twist1 did not show significant results regarding the benign/malignant nature of the lesions (p > 0.05). Regarding the PA histopathological patterns and ACC histological subtypes, no statistically significant differences were observed between the immunoexpressions of the studied proteins, similarly for the anatomical location of the cases in our sample (p > 0.05). When evaluating possible differences between the immunoexpression of E-cadherin proteins (cytoplasmic and membrane) and Twist1 with the clinical characteristics of malignant neoplasms (ACC and CXPA), statistically significant differences were evidenced between a higher expression of cytoplasmic E-cadherin in tumors of larger size (p = 0.024). E-cadherin membrane immunoexpression did not show statistically significant results for any of the clinical parameters investigated in the malignant neoplasms included in the present study (p > 0.05). Our results suggest the participation of these proteins in salivary gland neoplasms, in addition to the fact that the high cytoplasmic expression of E-cadherin may be indicative of tumors with worse clinical behavior (AU).

Evaluating mmp-2 and tgfß-ri expression in circulating tumor cells of pancreatic cancer patients and their correlation with clinical evolution / Avaliação da expressão de mmp-2 e tgfß-ri em células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pâncreas e sua correlação com evolução clínica

ABSTRACT Background: Metastasis is common in the diagnosis of pancreatic cancer, and the presence of epithelial-mesenchymal transition markers in circulating tumor cells may suggest worse prognosis. Aim: To correlate the number of circulating tumor cells (CTCs) in the peripheral blood of patients with a locally advanced or metastatic pancreatic tumor and the protein expression involved in epithelial-mesenchymal transition (EMT) in CTCs with clinical characteristics, progression-free survival (PFS) and overall survival (OS). Method: This was a prospective study conducted using peripheral blood samples collected at three different times. CTCs were quantified by the ISET test and analyzed by immunocytochemistry. Proteins involved in EMT (vimentin, TGFß-RI and MMP2) were analyzed in all CTCs. Results: Twenty-one patients were included. Median CTCs detected were 22, 20 and 8 CTCs/8 ml blood at baseline, first and second follow-up, respectively. No statistically significant correlation was found in correlating the number of CTCs and the evaluated clinical characteristics, PFS, or OS. There was no difference in PFS and OS among the EMT markers in the groups with and without markers. Conclusion: CTC analysis was not relevant in this sample for comparing clinical findings, PFS and OS in patients with pancreatic cancer. However, marker analysis in CTCs could be useful for the MMP-2 and/or TGFß-RI expression, as observed by the separate PFS curve.

RESUMO Racional: A metástase é comum no diagnóstico de câncer de pâncreas; presença de marcadores de transição epitélio-mesenquimal nas células tumorais circulantes (CTCs) podem sugerir pior prognóstico. Objetivo: Correlacionar o número de CTCs no sangue periférico de pacientes com tumor de pâncreas localmente avançado ou metastático e expressão de proteínas envolvidas na transição epitélio-mesenquimal (TEM) nas CTCs com características clínicas, sobrevida livre de progressão (SLP) e global (SG). Método: Estudo prospectivo realizado por meio de coletas de sangue periférico em três tempos distintos. As CTCs foram quantificadas pelo sistema ISET e analisadas por imunocitoquímica. Proteínas envolvidas na TEM (vimentina, TGFß-RI e MMP2) foram analisadas em todas as CTCs. Resultados: Foram incluídos 21 pacientes. A mediana de CTCs detectadas foi de 22, 20 e 8 CTCs/8 ml de sangue no baseline, primeiro e segundo seguimentos, respectivamente. Na correlação entre número de CTCs e as características clínicas levantadas, SLP, SG não houve correlação estatisticamente significante. Nos marcadores de TEM não houve diferença de SLP e SG entre os grupos que apresentaram e não apresentaram marcação. Conclusão: As CTCs não se mostraram relevantes na comparação dos achados clínicos, SLP e SG em pacientes com câncer de pâncreas. No entretanto, pode ser que para a análise de marcador seja útil, como observado pelas curvas separadas de expressão de MMP-2 e TGFß-RI nas CTCs.

Interação tumor-estroma durante a transição epitéliomesenquimal in vitro: envolvimento da integrina a11b1 e modulação da Crotoxina sobre este processo / Tumor-stroma interaction during in vitro epithelialmesenchymal transition: involvement of integrin a11 B1 and modulatory effect of Crotoxin on this process

During tumor progression, tumor cells are regulated by the microenvironment and acquire highly proliferative behavior within the epithelial compartment, having as characteristic the high motility and invasiveness to the adjacent stroma! tissue. This behavior is a result of the phenotypic alteration of epithelial tumor cells, due to a biological process called epithelial-rnesenchymal transition (EMT). ln this process, fibroblasts are pointed out as fundamental elements in the EMT induction, performing their functions via integrins. Recently, a11 has been shown to be a type I collagen receptor of mesenchyme-derived cells, particularly fibroblasts, which promote cell adhesion and migration to this substrate and may also contribute to the invasion of tumor cells, making it thus, an important target of study. Components obtained from snake venoms modulate integrin-mediated functions, resulting in modulation of cell signaling and consequently regulation of events involved with tumor progressions, such as proliferation, migration, and apoptosis. The aim of this study was 1) to evaluate in vitro the role of a11 integrin on EMT and its importance in the phenotype stabilization; 2) to evaluate the possible inhibitory effect of CTX on the function of this integrin in fibroblasts in spheroid model and; 3) to evaluate the modulatory effect of CTX on key markers in EMT in spheroid model. Firstly, epithelial cell lines (NMuMG and A549) treated with EMT-inducing factors were used to evaluate the expression of epithelial and mesenchymal markers. Secondly, the experimental model used was in vitro interaction between cancer-associated fibroblasts (CAFs-mock or CAF-a11) or normal fibroblasts (MRC-5) and tumor cell lines (A549 or Calu-3), evaluating: a) tumor cells proliferation inside the spheroids; b) invasion and migratory behavior of composite spheroids in type I collagen gel; c) secretion of TGF-ß1 by CAFs; d) expression of EMT markers: E-cadherin, N-cadherin, vimentin and a-SMA, by immunofluorescence assay and Western blotting; e) quantification of MMPs (9 and 13) by ELISA. Taken together, the data obtained allow us to assert that a11 integrin is modulated by growth factors involved with EMT and that its participation was fundamental for the stabilization of the myofibroblastic phenotype. CTX interfered with CAFs adhesion, tumor cells proliferation and its inhibitory effect during migration and cell invasion is more significant when the tumor-stroma interaction occurs in the spheroid model, accompanied by inhibition of the secretion of active TGF-ß1. Furthermore, CTX inhibited differentiation of MRC-5 cells in the tumor microenvironment and inhibited the expression of N-cadherin, a-SMA and av mesenchymal markers, evaluated in 2D or 3D matrices, by Western blot and confocal microscopy. This study shows CTX as an important modulatory molecule of the EMT process and highlights the mechanisms involved in the antitumor action described for CTX in experimental studies and clinical trials.

Durante a progressão tumoral, as células tumorais são reguladas pelo microambiente e adquirem comportamento altamente proliferativo dentro do compartimento epitelial, tendo como característica a alta motilidade e invasividade ao tecido estremai adjacente. Este comportamento é resultado da alteração fenotípica das células turnarais epiteliais, decorrente de um processo biológico denominado transição epitélio-mesenquimal (EMT). Neste processo, os fibroblastes são apontados como elementos fundamentais na indução da EMT, desempenhando suas funções via integrinas. Muito recentemente, foi demonstrado que a a11 é um receptor para colágeno tipo I de células derivadas do mesênquima, particularmente de fibroblastes, que promovem a adesão e migração celular a este substrato podendo, ainda, contribuir para a invasão das células turnarais, tornando-a assim, um importante alvo de estudo. Componentes obtidos de venenos de serpentes modulam funções mediadas por integrinas, resultando na modulação da sinalização celular e consequentemente, sobre a regulação de eventos envolvidos com a· progressão tumoral, tais como a proliferação, migração e apoptose. Portanto, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar in vitro a participação da integri na a11 sobre a EMT e sua importância na estabilização do fenótipo; 2) avaliar o possível efeito inibitório da CTX sobre a função desta integrina em fibroblastes no modelo de esferóide e; 3) avaliar o efeito modulatório da CTX sobre os marcadores-chave na EMT, em modelo de esferóide. Para tanto, primeiramente, foi utilizado linhagens de células epiteliais (NMuMG e A549) tratadas com fatores indutores da EMT para avaliação da expressão dos marcadores epiteliais e mesenquimais. Para o segundo delineamento experimental, foi empregado a interação in vitro entre as linhagens de fibroblastos associados ao câncer (CAFs-mock ou CAF-a11) ou fibroblastos normais (MRC-5) e as linhagens de célula tumoral (A549 ou Calu-3) no modelo de esferóide, avaliando-se: a) a proliferação de células turnarais dentro dos esferóides; b) a invasão e o comportamento migratório dos esferóides compostos no gel de colágeno tipo I; c) a secreção de TGF-ß1 pelas CAFs; d) a expressão das moléculas-chave da EMT: E-caderina, N-caderina, vimentina e a-SMA, por meio do ensaio de imunofluorescência e de Western blotting; e) quantificação de MMPs (9 e 13) por ELISA. Em conjunto, os dados obtidos nos permite afirmar que a integrina a11 é modulada por fatores de crescimentos envolvidos com a EMT e que sua participação foi fundamental para estabilização do fenótipo miofibroblástico. CTX interferiu com a adesão de CAFs e proliferação das células tumorais. O efeito inibitório da CTX durante a migração e invasão celular foi mais significativo quando ocorreu a interação tumor-estroma no modelo de esferóide, acompanhado da inibição da secreção de TGF-ß1 ativo. Ainda, a CTX inibiu a diferenciação de células MRC-5 no microambiente tumoral e inibiu a expressão dos marcadores mesenquimais Ncaderina, a-SMA e av, avaliados em matrizes 20 ou 30, por Western blot e microscopia confocal. Este estudo mostra a CTX como importante molécula moduladora do processo EMT e evidencia os mecanismos envolvidos na ação antitumoral descrita para a CTX em estudos experimentais e ensaios clínicos.

Interação tumor-estroma durante a transição epitéliomesenquimal in vitro: envolvimento da integrina a11b1 e modulação da Crotoxina sobre este processo. / Tumor-stroma interaction during in vitro epithelialmesenchymal transition: involvement of integrin a11 B1 and modulatory effect of Crotoxin on this process.

During tumor progression, tumor cells are regulated by the microenvironment and acquire highly proliferative behavior within the epithelial compartment, having as characteristic the high motility and invasiveness to the adjacent stroma! tissue. This behavior is a result of the phenotypic alteration of epithelial tumor cells, due to a biological process called epithelial-rnesenchymal transition (EMT). ln this process, fibroblasts are pointed out as fundamental elements in the EMT induction, performing their functions via integrins. Recently, a11 has been shown to be a type I collagen receptor of mesenchyme-derived cells, particularly fibroblasts, which promote cell adhesion and migration to this substrate and may also contribute to the invasion of tumor cells, making it thus, an important target of study. Components obtained from snake venoms modulate integrin-mediated functions, resulting in modulation of cell signaling and consequently regulation of events involved with tumor progressions, such as proliferation, migration, and apoptosis. The aim of this study was 1) to evaluate in vitro the role of a11 integrin on EMT and its importance in the phenotype stabilization; 2) to evaluate the possible inhibitory effect of CTX on the function of this integrin in fibroblasts in spheroid model and; 3) to evaluate the modulatory effect of CTX on key markers in EMT in spheroid model. Firstly, epithelial cell lines (NMuMG and A549) treated with EMT-inducing factors were used to evaluate the expression of epithelial and mesenchymal markers. Secondly, the experimental model used was in vitro interaction between cancer-associated fibroblasts (CAFs-mock or CAF-a11) or normal fibroblasts (MRC-5) and tumor cell lines (A549 or Calu-3), evaluating: a) tumor cells proliferation inside the spheroids; b) invasion and migratory behavior of composite spheroids in type I collagen gel; c) secretion of TGF-ß1 by CAFs; d) expression of EMT markers: E-cadherin, N-cadherin, vimentin and a-SMA, by immunofluorescence assay and Western blotting; e) quantification of MMPs (9 and 13) by ELISA. Taken together, the data obtained allow us to assert that a11 integrin is modulated by growth factors involved with EMT and that its participation was fundamental for the stabilization of the myofibroblastic phenotype. CTX interfered with CAFs adhesion, tumor cells proliferation and its inhibitory effect during migration and cell invasion is more significant when the tumor-stroma interaction occurs in the spheroid model, accompanied by inhibition of the secretion of active TGF-ß1. Furthermore, CTX inhibited differentiation of MRC-5 cells in the tumor microenvironment and inhibited the expression of N-cadherin, a-SMA and av mesenchymal markers, evaluated in 2D or 3D matrices, by Western blot and confocal microscopy. This study shows CTX as an important modulatory molecule of the EMT process and highlights the mechanisms involved in the antitumor action described for CTX in experimental studies and clinical trials.

Durante a progressão tumoral, as células tumorais são reguladas pelo microambiente e adquirem comportamento altamente proliferativo dentro do compartimento epitelial, tendo como característica a alta motilidade e invasividade ao tecido estremai adjacente. Este comportamento é resultado da alteração fenotípica das células turnarais epiteliais, decorrente de um processo biológico denominado transição epitélio-mesenquimal (EMT). Neste processo, os fibroblastes são apontados como elementos fundamentais na indução da EMT, desempenhando suas funções via integrinas. Muito recentemente, foi demonstrado que a a11 é um receptor para colágeno tipo I de células derivadas do mesênquima, particularmente de fibroblastes, que promovem a adesão e migração celular a este substrato podendo, ainda, contribuir para a invasão das células turnarais, tornando-a assim, um importante alvo de estudo. Componentes obtidos de venenos de serpentes modulam funções mediadas por integrinas, resultando na modulação da sinalização celular e consequentemente, sobre a regulação de eventos envolvidos com a· progressão tumoral, tais como a proliferação, migração e apoptose. Portanto, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar in vitro a participação da integri na a11 sobre a EMT e sua importância na estabilização do fenótipo; 2) avaliar o possível efeito inibitório da CTX sobre a função desta integrina em fibroblastes no modelo de esferóide e; 3) avaliar o efeito modulatório da CTX sobre os marcadores-chave na EMT, em modelo de esferóide. Para tanto, primeiramente, foi utilizado linhagens de células epiteliais (NMuMG e A549) tratadas com fatores indutores da EMT para avaliação da expressão dos marcadores epiteliais e mesenquimais. Para o segundo delineamento experimental, foi empregado a interação in vitro entre as linhagens de fibroblastos associados ao câncer (CAFs-mock ou CAF-a11) ou fibroblastos normais (MRC-5) e as linhagens de célula tumoral (A549 ou Calu-3) no modelo de esferóide, avaliando-se: a) a proliferação de células turnarais dentro dos esferóides; b) a invasão e o comportamento migratório dos esferóides compostos no gel de colágeno tipo I; c) a secreção de TGF-ß1 pelas CAFs; d) a expressão das moléculas-chave da EMT: E-caderina, N-caderina, vimentina e a-SMA, por meio do ensaio de imunofluorescência e de Western blotting; e) quantificação de MMPs (9 e 13) por ELISA. Em conjunto, os dados obtidos nos permite afirmar que a integrina a11 é modulada por fatores de crescimentos envolvidos com a EMT e que sua participação foi fundamental para estabilização do fenótipo miofibroblástico. CTX interferiu com a adesão de CAFs e proliferação das células tumorais. O efeito inibitório da CTX durante a migração e invasão celular foi mais significativo quando ocorreu a interação tumor-estroma no modelo de esferóide, acompanhado da inibição da secreção de TGF-ß1 ativo. Ainda, a CTX inibiu a diferenciação de células MRC-5 no microambiente tumoral e inibiu a expressão dos marcadores mesenquimais Ncaderina, a-SMA e av, avaliados em matrizes 20 ou 30, por Western blot e microscopia confocal. Este estudo mostra a CTX como importante molécula moduladora do processo EMT e evidencia os mecanismos envolvidos na ação antitumoral descrita para a CTX em estudos experimentais e ensaios clínicos.

Avaliação do efeito do tratamento quimioterápico sobre eventos celulares relacionados com a metástase no osteossarcoma / Evaluation of chemotherapy effect on cellular events related to metastasis in osteosarcoma

O osteossarcoma é o tumor maligno primário mais frequente do osso e afeta principalmente os ossos dos membros inferiores de crianças e adolescentes. Embora o tratamento quimioterápico seja realizado com a combinação de fármacos, como doxorrubicina (DOX), cisplatina (CIS) e metotrexato (MTX), os pacientes desenvolvem com frequência metástases e recidiva. A transição epitéliomesenquimal (EMT) é um processo no qual as células epiteliais sofrem alterações bioquímicas, assumindo o fenótipo de células mesenquimais, que pela maior capacidade migratória e maior potencial de invasão está relacionada com o desenvolvimento de metástases. O objetivo geral deste estudo foi investigar a ocorrência de metástase em pacientes portadores de osteossarcoma e avaliar o efeito do tratamento quimioterápico in vitro sobre processos celulares relacionados com a metástase. Especificamente, analisamos (i) o momento da ocorrência da metástase em pacientes portadores de osteossarcoma em relação ao tratamento quimioterápico; (ii) a expressão de biomarcadores de EMT (E-caderina, claudina-1, zona ocludina (ZO-1), snail, N-caderina, ß-catenina, slug e vimentina) em células primárias de osteossarcoma isoladas de seis pacientes antes e após o tratamento quimioterápico e (iii) o efeito in vitro de agentes farmacológicos utilizados em protocolos de quimioterapia do osteossarcoma sobre a expressão dos biomarcadores de EMT e sobre a migração celular em culturas primárias estabelecidas a partir de amostras tumorais. As metástases ocorreram em 57,5% dos pacientes, sendo que dentre estes em 73,7% ocorreu na vigência do tratamento quimioterápico. A identidade óssea das culturas primárias foi conferida pela expressão de osteoprotegerina. Não houve diferença na expressão dos marcadores de EMT antes e depois da quimioterapia. Embora sem significância estatística, houve redução na expressão do marcador snail, E-caderina e ZO-1. Os marcadores mesenquimais (E-catenina, slug) e epitelial (claudina-1) permaneceram estáveis ou aumentaram ligeiramente (N-caderina e vimentina) depois da quimioterapia. No experimento in vitro a maior expressão de N-caderina e de vimentina ocorreu nas células tratadas simultaneamente com todos os agentes. A maior expressão de snail e slug foi observada na exposição isolada ao metotrexato. A expressão de Ecatenina não diferiu entre os diferentes tratamentos. Embora os resultados do presente estudo não nos permitam avançar no conhecimento sobre os mecanismos que controlam e regulam a evolução clínica do osteossarcoma, acreditamos que demos o passo inicial no sentido de definir marcadores, que potencialmente possam ser utilizados na caracterização biológica das diversas variantes do osteossarcoma e, desta forma, atuar com maior precisão no acompanhamento clínico e biológico da doença

Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor and affects mainly the bones of the lower limbs in children and adolescents. Although chemotherapy is carried out with a combination of drugs such as doxorubicin (DOX), cisplatin (CIS) and methotrexate (MTX), patients often develop metastasis and recurrence. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a process in which epithelial cells undergo biochemical changes, assuming the phenotype of mesenchymal cell with higher migration ability and increased potential for invasion and thus, to the development of metastasis. The aim of this study was to investigate the occurrence of metastasis in patients with osteosarcoma and evaluate the in vitro effect of chemotherapy on cellular processes related to metastasis. Specifically, we analyzed (i) the time of occurrence of metastasis in patients with osteosarcoma in relation to chemotherapy; (ii) expression of EMT biomarkers (E-cadherin, claudin-1, occludin zone (ZO-1), snail, N-cadherin, ß-catenin, slug and vimentin) in isolated osteosarcoma primary cells from six patients before and after chemotherapy and (iii) the in vitro effect of pharmacological agents used in chemotherapy protocols for osteosarcoma on the expression of EMT biomarkers and on cell migration both in primary cultures established from tumor samples. Metastasis occurred in 57.5% of patients and in 73.7% it took place during chemotherapy. Bone identity of primary cultures was conferred by osteoprotegerin expression. There was no difference in the expression of EMT markers before and after chemotherapy. Although not statistically significant, there was a reduction in the expression of markers snail, E-cadherin and ZO-1. The mesenchymal markers (ß-catenin, slug) and epithelial marker claudin-1 remained stable or increased slightly (N-cadherin and vimentin) after chemotherapy. In the in vitro experiment, most N-cadherin and vimentin expression occurred in cells treated simultaneously with all agents. The greatest expression of snail and slug was observed in isolated exposure to methotrexate. The ß-catenin expression did not differ between the different treatments. Although the results of this study do not allow us to advance in the knowledge about the mechanisms that control and regulate the clinical progression of osteosarcoma, we believe that we have taken the first step to define markers that may potentially be used in the biological characterization of the different variants of osteosarcoma and thus operate with greater precision in biological and clinical monitoring of the disease

Carcinomas uroteliais de bexiga: aspectos anatomopatológicos e imuno-histoquímicos. Pesquisa de metaloproteinases de matriz utilizando a técnica de tissue microarray (TMA) / Urothelial carcinomas of the urinary bladder: morphological and immunohistochemical aspects. Expression of the matrix metalloproteinases using the tissue microarray (TMA) technique

OBJETIVOS: Estudar variáveis anatomopatológicas relacionadas à progressão tumoral em carcinomas uroteliais primários de bexiga e sua associação com a imunoexpressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) - 2, -9 e -14 no epitélio e no estroma dos tumores primários e nas metástases linfonodais. MÉTODOS: Sessenta e um casos de carcinomas uroteliais musculoinvasivos ou localmente avançados primários da bexiga operados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP e no Instituto do Câncer do Estado de São Paulo, sendo 34 casos com metástase para linfonodo regional, foram caracterizados quanto ao gênero, idade, tamanho, focalidade, grau histológico, tipo/configuração neoplásica, tipo papilífero da neoplasia, padrão arquitetural de invasão tumoral, grau de atipia nuclear, componente sarcomatoide, diferenciações escamosa e glandular, variante histológica, invasões linfovascular e perineural, carcinoma in situ, estádio do tumor primário, metástase para linfonodo regional, tamanho da metástase e extensão extranodal. Amostras teciduais de 1,0 mm foram dispostas em micromatrizes teciduais (TMA) para pesquisa imuno-histoquímica (IH) das enzimas MMP-2, MMP-9 e MMP-14. A expressão IH das MMPs foi graduada em uma escala semiquantitativa de 0 (ausência de expressão) até 20 (maior expressão). As associações entre a imunoexpressão das MMPs de forma global, no epitélio e estroma do tumor primário e na metástase linfonodal com as variáveis anatomopatológicas foram avaliadas através do teste do qui-quadrado de Pearson, sendo consideradas significativas ao nível de p<0,05. RESULTADOS: Trinta e seis, 57 e 60 casos do tumor primário foram positivos para MMP-2, MMP-9 e MMP-14, respectivamente. Nas metástases linfonodais, 20, 27 e 26 casos foram positivos para MMP-2, MMP-9 e MMP-14, respectivamente. A imunoexpressão global de MMP-2 no tumor primário mostrou-se associada com o padrão arquitetural de invasão (p=0,022) e sua expressão no estroma com o grau de atipia...

OBJECTIVES: To study morphological features related to tumor progression in urothelial carcinoma of the urinary bladder and its association with immunohistochemical (IHC) expression of matrix metalloproteinases (MMPs) -2, -9 and -14 in epithelial and stromal cells of primary tumor and regional lymph node metastases. METHODS: Sixty-one cases of muscle-invasive or locally advanced urothelial carcinomas of the bladder operated on Clinic's Hospital of Faculty Medicine Sao Paulo University and the Cancer Institute of the State of Sao Paulo, with 34 cases showing regional lymph nodes metastases, were characterized regarding gender, age, tumor size, multifocality, histological grade, neoplastic type/configuration, papillary type, architectural pattern of invasive tumor, nuclear atypia, sarcomatoid component, squamous and glandular diffentiation, histological variants, lymphovascular and perineural invasion, carcinoma in situ, tumor stage, metastases to regional lymph nodes, metastases size and extranodal extension. Tissue samples of 1.0 mm were arranged in tissue microarrays blocks (TMA) for IHC detection of MMP-2, MMP-9 and MMP-14. The grading of expression of MMPs was determined to a semiquantitative scale from 0 (absence) to 20 (higher expression). The associations between the IHC global expression of MMPs, in epithelium and in stromal cells of the primary tumor and in the lymph node metastases with the morphological features were obtained through Pearson's chi-square (significant at p<0.05). RESULTS: Thirty-six, 57 and 60 cases of primary tumor were positive for MMP-2, MMP-9 and MMP-14 respectively. In the lymph nodes metastases, 20, 27 and 26 cases were positive for MMP-2, MMP-9 and MMP-14 respectively. The global IHC expression of MMP-2 in primary tumor has been associated with the architectural pattern of invasion (p=0.022). The expression in stromal cells were correlated with the degree of nuclear atypia (p=0.032) and the percentage of sarcomatoid...