Caracterização da letalidade dos venenos de serpentes Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus, por meio de ensaio em ovos embrionados de galinha

Em 2017, a Organização Mundial da Saúde voltou a considerar o ofidismo como uma doença tropical negligenciada de maior prioridade. As serpentes do gênero Bothrops têm destaque por serem responsáveis por mais de 90% dos acidentes ocorridos no Brasil. Já o gênero Crotalus apresenta um percentual de 7,7%, com letalidade maior nos acidentes crotálicos (1,87%) (Fundação Nacional de Saúde, 1988). O ensaio em ovos embrionados de galinha (OEG), representa um modelo in vivo, alternativo ao teste convencional em camundongos para teste de letalidade, sendo um método bastante eficaz e versátil para estudos pré-clínicos, podendo também atuar de forma complementar aos testes in vitro. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo analisar, por meio de ensaio em OEG, a determinação da letalidade induzida pelos venenos, obtidos do laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan de Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus. Foi feita a avaliação da aplicabilidade de doses desafio desses venenos para calcular a dose letal 50% (DL50). Nesta pesquisa, foram utilizados 300 ovos fertilizados de galinhas da linhagem Novogen White, SPF, em embriões de 6 e 7 dias de desenvolvimento. Os OEG foram incubados a 37oC e 62% de umidade relativa até o momento de inoculação. Nos OEG, foram inoculados na cavidade alantoide, os venenos de B. jararaca (VBj) as concentrações de VBj: 84,2 μg a 2,63125 μg/ovo e C. durissus terrificus (VCdt) as concentrações de VCdt: 5,74 μg a 0,179375 μg/ovo, tendo como grupos controles o crescimento de ovos sem qualquer inoculação (GC) e controles inoculados com salina (GS) em paralelo. Os embriões foram analisados por meio de ovoscopia manual, após os tempos de incubação, nos intervalos de 24 horas e 48 horas, para avaliação da função vascular. Foi realizada a inspeção macroscópica das lesões dos embriões mortos e registro fotográfico. Os resultados obtidos de dose letal 50% (DL50) em OEG no teste de VCdt foram de DL50=0,8035 μg/ovo nos embriões de 6 dias e DL50=0,09113 μg/ovo nos embriões de 7 dias de desenvolvimento. Já o teste para VBj os valores estimados de DL50 foram de DL50=21,91 μg/ovos nos embriões de 6 dias e DL50=24,37 μg /ovo em embriões de 7 dias de vida embrionária. Os valores de DL50 obtidos em OEG ao serem comparados com os valores de DL50 em camundongos, demostraram ter boa correspondência entres as metodologias. A partir do uso dessa técnica, verificou-se que os OEG podem ser utilizados como alternativo ao método convencional em camundongos.

Caracterização de adaptações do repertório molecular de serpentes das tribos Xenodontini e Pseudoboini relacionadas à sua ecologia de predação

Among the wide spectrum of food ecologies, some groups of snakes have become ophiophagous, feeding mainly on other snakes. Due to the relationship between diet and venom composition, these ophiophagous groups probably needed to develop specific toxins targeting snakes and some type of resistance to the venoms of the snakes they preyed on, associating these characteristics with the development of ophiophagy. In the Neotropics, more precisely in the Dipsadidae family, there are several ophiophagous species. The genus Erythrolamprus (Tribe Xenodontini) and the genera Clelia and Boiruna (Tribe Pseudoboini) contain species that are specialists in snakes. However, due to their relatively low medical relevance, they have been poorly studied and there is scarce information about their venoms and possible resistance factors or mechanisms. In the present work, the toxin composition of the venom gland transcriptome of 8 genera and 19 species of the tribe Pseudoboini and 3 genera and 8 species of the tribe Xenodontini was analyzed. In addition to being the first compositional analysis of the venom of the two tribes, a new type of enzymatic toxins exclusive to the Dipsadidae family (the svMMPs) was identified and characterized in the analyzed samples, as well as high expression levels of a type of phospholipases A2 in some species of the Pseudoboini tribe was detected. On the other hand, comparisons between liver transcriptomes and plasma proteomes of ophiophagous and non-ophiophagous species of the tribe Pseudoboini allowed identifying high expression levels of several types of toxin inhibitors. However, the occurrence of overexpression of these inhibitors in ophiophagous species was not detected. The analyzes revealed, in a broad scale, the evolutionary novelties present in the compositional profile of the venoms of the two tribes and verified the occurrence of plasma toxin inhibitors in the analyzed species.

Dentre o amplo espectro de ecologias alimentares, alguns grupos de serpentes tornaram-se ofiófagos, alimentando-se principalmente de outras serpentes. Devido à relação entre a dieta e a composição do veneno, esses grupos ofiófagos provavelmente precisaram desenvolver toxinas específicas para serpentes e algum tipo de resistência aos venenos das serpentes que predavam, associando essas características ao desenvolvimento da ofiofagia. Nos neotrópicos, mais precisamente na família Dipsadidae, ocorrem diversas espécies ofiófagas. O gênero Erythrolamprus (Tribo Xenodontini) e os gêneros Clelia e Boiruna (Tribo Pseudoboini) contêm espécies especialistas em serpentes. No entanto, devido à sua relevância médica relativamente baixa, foram pouco estudados e existem poucas informações sobre seus venenos e possíveis fatores ou mecanismos de resistência. No presente trabalho foi analisada a composição de toxinas do transcriptoma da glândula de veneno de 8 gêneros e 19 espécies da tribo Pseudoboini e de 3 gêneros e 8 espécies da tribo Xenodontini. Além de ser a primeira análise composicional do veneno das duas tribos, permitiu a identificação e caracterização de um novo tipo de toxinas enzimáticas exclusivo da família Dipsadidae (as svMMPs), assim como revelou níveis de expressão elevados de um tipo de fosfolipases A2 em algumas espécies da tribo Pseudoboini. Por outro lado, as comparações entre os transcriptomas do fígado e os proteomas do plasma de espécies ofiófagas e não ofiófagas da tribo Pseudoboini indicaram níveis de expressão elevados de vários tipos de inibidores de toxinas. Porém, não foi detectada a ocorrência de sobre expressão destes inibidores nas espécies ofiófagas. As análises revelaram, em escala abrangente, as novidades evolutivas presentes no perfil composicional dos venenos das duas tribos e verificaram a ocorrência de inibidores de toxinas plasmáticos nas espécies analisadas.

Venenos de serpentes do gênero Bothrops: impacto da glicosilação na complexidade dos proteomas e função de toxinas / Bothrops snake venoms: impact of glycosylation on the complexity of proteomes and toxins function

A variabilidade estrutural é uma característica das proteínas de venenos de serpentes, e a glicosilação é uma das principais modificações pós-traducionais que contribui para a diversificação de seus proteomas. Recentes estudos de nosso grupo demonstraram que venenos do gênero Bothrops são marcadamente definidos pelo seu conteúdo de glicoproteínas, e que a maioria das estruturas de N-glicanos dos tipos híbrido e complexo identificados em oito venenos deste gênero contêm unidades de ácido siálico. Em paralelo, em glicoproteínas do veneno de B. cotiara foi identificada a presença de uma estrutura de N-acetilglicosamina bissecada. Assim, com o objetivo de investigar a variação do conteúdo de glicoproteínas, assim como os mecanismos envolvidos na geração dos diferentes venenos de Bothrops, neste estudo foram analisados comparativamente os glicoproteomas de nove venenos do gênero Bothrops (B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas, B. fonsecai, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi). As abordagens glicoproteômicas envolveram cromatografia de afinidade e ensaio de pull-down utilizando, respectivamente, as lectinas SNA (aglutinina de Sambucus nigra) e MAL I (lectina de Maackia amurensis), que mostram afinidade por unidades de ácido siálico nas posições, respectivamente, α2,6 e α2,3; e cromatografia de afinidade com a lectina PHA-E (eritroaglutinina de Phaseolus vulgaris), que reconhece N-acetilglicosamina bissecada. Ainda, eletroforese de proteínas, blot de lectina, e identificação de proteínas por espectrometria de massas foram empregadas para caracterizar os glicoproteomas. As lectinas geraram frações dos venenos enriquecidas de diferentes componentes, onde as principais classes de glicoproteínas identificadas foram metaloprotease, serinoprotease, e L-amino ácido oxidase, além de outras enzimas pouco abundantes nos venenos. Os diferentes conteúdos de proteínas reconhecidas por essas lectinas, com especificidades distintas, ressaltaram novos aspectos da variabilidade dos subproteomas de glicoproteínas desses venenos, dependendo da espécie. Ainda, considerando que metaloproteases e serinoproteases são componentes abundantes nesses venenos e fundamentais no quadro de envenenamento botrópico, e que estas enzimas contêm diversos sítios de glicosilação, o papel das unidades de ácido siálico na atividade proteolítica das mesmas foi avaliado. Assim, a remoção enzimática de ácido siálico (i) alterou o padrão de gelatinólise em zimografia da maioria dos venenos, (ii) diminuiu a atividade proteolítica de alguns venenos sobre o fibrinogênio e a atividade coagulante do plasma humano de todos os venenos, e (iii) alterou o perfil de hidrólise de proteínas plasmáticas pelo veneno de B. jararaca, indicando que este carboidrato pode desempenhar um papel na interação das proteases com seus substratos proteicos. Em contraste, o perfil da atividade amidolítica dos venenos não se alterou após a remoção de ácido siálico e incubação com o substrato Bz-Arg-pNA, indicando que ácido siálico não é essencial em N-glicanos de serinoproteases atuando sobre substratos não proteicos. Em conjunto, esses resultados expandem o conhecimento sobre a variabilidade de proteomas de venenos do gênero Bothrops e apontam a importância das cadeias de carboidratos contendo ácido siálico nas atividades enzimáticas das proteases desses venenos

Structural variability is a feature of snake venom proteins, and glycosylation is one of the main post-translational modifications that contributes to the diversification of venom proteomes. Recent studies by our group have shown that Bothrops venoms are markedly defined by their glycoprotein content, and that most hybrid and complex N-glycan structures identified in eight venoms of this genus contain sialic acid units. In parallel, the presence of a bisected N-acetylglucosamine structure was identified in B. cotiara venom glycoproteins. Thus, with the aim of investigating the variation in the content of glycoproteins, as well as the mechanisms involved in the generation of different Bothrops venoms, in this study the glycoproteomes of nine Bothrops venoms (B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas, B. fonsecai, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi) were comparatively analyzed. The glycoproteomic approaches involved affinity chromatography and pulldown using, respectively, the lectins SNA (Sambucus nigra agglutinin) and MAL I (Maackia amurensis lectin), which show affinity for sialic acid units at positions, respectively, α2,6 and α2,3, and affinity chromatography with PHA-E (Phaseolus vulgaris erythroagglutinin), which recognizes bisected N-acetylglucosamine. In addition, protein electrophoresis, lectin blot, and protein identification by mass spectrometry were employed for glycoproteome characterization. The lectins generated venom fractions enriched with different components, where the main classes of glycoproteins identified were metalloprotease, serine protease, and L-amino acid oxidase, in addition to other low abundant enzymes. The different contents of proteins recognized by these lectins of distinct specificities highlighted new aspects of the variability of the glycoprotein subproteomes of these venoms, depending on the species. Furthermore, considering that metalloproteases and serine proteases are abundant components of these venoms and essential in Bothrops envenomation, and that these enzymes contain several glycosylation sites, the role of sialic acid units in their proteolytic activities was evaluated. Thus, enzymatic removal of sialic acid (i) altered the pattern of gelatinolysis in zymography of most venoms, (ii) decreased the proteolytic activity of some venoms on fibrinogen and the clotting activity of human plasma of all venoms, and (iii) altered the hydrolysis profile of plasma proteins by B. jararaca venom, indicating that this carbohydrate may play a role in the interaction of proteases with their protein substrates. In contrast, the profile of amidolytic activity of the venoms did not change after removal of sialic acid and incubation with the substrate Bz-Arg-pNA, indicating that sialic acid is not essential in N-glycans of serine proteases acting on small substrates. Together, these results expand the knowledge about the variability of proteomes of Bothrops venoms and point to the importance of carbohydrate chains containing sialic acid in the enzymatic activities of venom proteases

Participação das células gliais na hiperalgesia induzida pelo veneno de Bothrops jararaca e pelo conteúdo plaquetário: efeito da depleção de plaquetas circulantes

Pain has a protective and adaptive role in the body, and is essential to alert about harmful stimuli in the environment. In this context, the increased response to painful stimuli is called hyperalgesia, in which astrocytes and microglia, presente in the spinal cord, act in the central mediation of this effect. Studies from our group demonstrated that platelets are involved in hyperalgesia induced by carrageenan and Bothrops jararaca venom (Bjv). Furthermore, it was observed that whole platelets or platelet releasate (PR) also induce hyperalgesia, suggesting that these cells play a crucial role in the genesis of inflammatory pain. Considering this information, the aim of this project is evaluate the participation of microglia and astrocytes, presente in the spinal cord, during the peak of hyperalgesia evoked by Bjv or by PR, as weel as the involvement of platelets in changes observed in glial cells. Hyperalgesia was assessed by analgesy-meter 2 hours after intraplantar (i.pl) injection of Bjv and PR, associated or not with different treatments, such as anti-rat platelet antibody (which causes depletion of circulating platelets) and minocycline (inhibit microglial activation). The results showed that both Bjv and PR induced hyperalgesia, wich was abolished by depletion of platelets, reinforcing the importance of these cells in the development of hyperalgesia. Microglial blockade also inhibited hyperalgesia induced by Bjv and PR. To confirm the involvement of glial cells, ipsilateral side of spinal cord samples of vBj and CSP, obtained from animals submitted to the nociceptive test, were quantified in western blotting (WB) analysis for microglia (Iba-1) and astrocyte (GFAP). The expression of Iba-1 and GFAP was up-regulated in both groups, Bjv and PR. However, platelet depletion only inhibited microglia marking in Bjv group, not interfering with the glial markers in the PR group, indicating that there is a relationship between circulating platelets and microglial activation during hyperalgesia evoked by Bjv. The role of NK1 receptors in hyperalgesia evoked by Bjv was also evaluated. The data obtained demonstrated that the NK1 receptor antagonist (GR 82334) inhibited the venom hyperalgesia. Furthermore, an increase in the expression of NK1 receptors was detected in the spinal cord of animals injected with Bjv by WB, suggesting that NK1 receptors participate in the central mediation of this effect. Platelet depletion did not interfere with this effect. Taken together, these datas confirm the participation of circulating platelets in the genesis of hyperalgesia and demonstrate the involvement of microglial and astrocytic cells in the central mediation of hyperalgesia induced by Bjv and PR. Furthermore, the results suggest that the increase in microglial expression induced by Bjv is dependent on circulating platelets. In addition, suggest that the hyperalgesic effect of Bjv is mediated, at least in part, by NK1 receptors.

A dor tem um papel protetor e adaptativo no organismo, além de ser essencial para alertar sobre estímulos nocivos no ambiente. Neste contexto, é chamada de hiperalgesia a resposta aumentada aos estímulos dolorosos, em que microgliais e astrócitos, presentes na medula espinal, participam da mediação central desse efeito. Estudos do nosso grupo demonstraram que as plaquetas circulantes estão envolvidas na hiperalgesia induzida pela carragenina e pelo veneno de serpentes Bothrops jararaca (vBj). Ainda, foi observado que plaquetas íntegras e o conteúdo de secreção plaquetária (CSP) também induzem hiperalgesia, sugerindo que estas células desempenham papel primordial na gênese da dor inflamatória. Considerando estas informações, o objetivo deste projeto é determinar a participação da microglia e do astrócito, presentes na medula espinal, no desencadeamento da hiperalgesia induzida pelo vBj ou pelo CSP, bem como o envolvimento das plaquetas circulantes nas alterações observadas nas células gliais. A hiperalgesia foi avaliada pelo teste de pressão de pata de ratos após 2 horas da injeção intraplantar (i.pl) do vBj ou do CSP, pico da hiperalgesia, associadas ou não aos tratamentos prévios com anticorpo anti-plaqueta de rato, que causa a depleção de plaquetas circulantes, ou com minociclina (bloqueador da microglia). Os resultados obtidos demonstraram que tanto o vBj quanto o CSP induziram hiperalgesia, a qual foi abolida pela depleção de plaquetas circulantes, confirmando a importância dessas células no desencadeamento desse efeito. O bloqueio da microglia também inibiu a hiperalgesia causada pelo vBj e CSP. Para verificar a participação das células gliais na hiperalgesia observada, amostras da medula espinal no lado ipsilateral a injeção i.pl. do vBj e do CSP, obtidas de animais submetidos ao teste nociceptivo, foram avaliadas em ensaio de western blotting (WB) para marcação de microglia (Iba-1) e astrócito (GFAP). Os resultados demonstraram maior expressão de ambos os marcadores tanto no grupo vBj quanto no CSP. Entretanto, a depleção de plaquetas inibiu apenas a marcação da microglia no grupo vBj, não interferindo com a marcação dos astrócitos ou com os marcadores gliais no grupo CSP, indicando que existe uma relação entre as plaquetas circulantes e a ativação da microglia durante a hiperalgesia induzida pelo vBj. Também foi investigado o envolvimento dos receptores NK1 para taquicininas na hiperalgesia acarretada pelo vBj. Os dados obtidos demostraram que o antagonista de receptores NK1 (GR 82334) inibiu a hiperalgesia induzida pelo veneno. Além disso, foi observado por WB aumento da expressão desses receptores na medula espinal de ratos injetados com o vBj, sugerindo que os receptores NK1 participam da mediação da hiperalgesia causada pelo veneno. A depleção de plaquetas não interferiu com esse efeito. Em conjunto, os dados apresentados confirmam a participação das plaquetas circulantes na gênese da hiperalgesia e demonstram o envolvimento das células microgliais e astrocitárias na mediação central da hiperalgesia induzida pelo vBj e pelo CSP. Ademais, sugerem que a o aumento da expressão da microglia induzida pelo vBj é dependente das plaquetas circulantes. Ainda, que o efeito hiperalgésico do vBj é mediado, pelo menos em parte, por receptores NK1.

Clonagem e expressão de anticorpos recombinantes de cadeia única (scFvs) anti-crotoxina: original e mutantes sugeridos por modelagem molecular / Cloning and expression of recombinant single chain antibodies (scFv) anti-crotoxin: original and mutants suggested by molecular modeling

Accidents with snakes are a problem of public health. It is estimated that about 1.8 million poisonings by snakes occur every year worldwide, resulting in at least 94,000 deaths. This issue has been included in the list of neglected tropical diseases by the World Health Organization. Among the causative genera of snakebites in Brazil, the genus Crotalus has the highest coefficient of lethality. The venom of the rattlesnake Crotalus durissus terrificus (Cdt) is composed of a mixture of substances including toxins. The majority toxin and main toxic component of the venom is called crotoxin. It is highly toxic and is formed by subunits CA and CB. The administration of heterologous antibodies has been the treatment of choice for snake bite accidents. But its administration may cause hypersensitivity reactions. Furthermore, Crotalic antivenom production by horses is slow and hampered by the action of immunosuppressive components present in the venom of Cdt. Currently, recombinant antibody fragments are becoming popular alternative therapies for whole antibodies. Single chain fragment variable (scFv) comprise the VH and VL domains connected by a short linker flexible and may be useful as treatment for poisoning by snakes. Recombinant human antibodies anti-crotoxin have been previously isolated from a naive library of over 1010scFv by phage display technology. The aim of this study was the expression of original scFvs anti-crotoxin and mutants suggested by modeling molecular. ScFv6 3D model was constructed in silico. Docking and energy minimization calculations of CTX-antibody complex were also performed. From these simulations, three mutations were chosen. The S30A and Y31F mutants have mutation in CDR H2 and CDR H3 in the mutant R103H. The first mutant (S30A) was obtained by site-directed mutagenesis, while the other two (Y31F and R103H) were obtained from synthetic genes. ScFv original and mutants were cloned in pET20b + vector and expressed in E. coli C43 (DE3), resulting in soluble protein of approximately 30 kDa. Expression was induced with IPTG. After lysis, the bacterial content was purified by IMAC. The presence of the desired mutations was confirmed by sequencing. The secondary structure of scFvs was evaluated by circular dichroism and showed to be preserved. We conclude that original scFv and its mutants were clone and expressed successfully in soluble form. All scFv presented similar yield after purification. Moreover, they presented preserved secondary structure, as evaluated by circular dichroism.

Acidentes com serpentes são um problema de saúde pública. Estima-se que ocorram cerca de 1,8 milhões de envenenamentos por serpentes a cada ano no mundo, resultando em pelo menos 94 mil mortes. Tal problema foi incluído na lista de doenças tropicais negligenciadas da Organização Mundial da Saúde. Dentre o gêneros causadores de acidentes ofídicos no Brasil, o gênero Crotalus apresenta o maior coeficiente de letalidade. O veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus (Cdt) é composto por uma mistura de substâncias, dentre elas as toxinas. A toxina majoritária e principal componente tóxico do veneno é denominada crotoxina. É altamente tóxica e é formada por duas subunidades CA e CB. A administração de anticorpos heterólogos tem sido o tratamento de escolha para indivíduos que sofreram acidentes ofídicos. Porém, sua administração pode causar reações de hipersensibilidade, além da sua produção ser lenta e dificultada pela ação de componentes imunossupressores presentes no veneno de Cdt. Atualmente, fragmentos de anticorpos recombinantes estão se tornando alternativas terapêuticas populares para substituição de anticorpos íntegros. Fragmentos variáveis de cadeia única (scFv, do inglês, single chain fragmente variable) são compostos dos domínios VH e VL unidos por um pequeno linker flexível e podem ser úteis como terapia para o envenenamento por serpentes. Anticorpos recombinantes humanos anti-crotoxina foram isolados previamente de uma biblioteca naive de mais 1010scFvs pela tecnologia de phage display. O objetivo desse estudo foi a expressão de scFvs anticrotoxina original e mutantes sugeridos por modelagem molecular. Um modelo 3D do scFv6 foi construído por modelagem in silico. Docking e cálculos de minimização de energia do complexo anticorpo-CTX também foram realizados. A partir dessas simulações, três mutações foram escolhidas. Os mutantes S30A e Y31F apresentam mutação no CDR H2 e o mutante R103H no CDR H3. O primeiro mutante (S30A) foi obtido por mutagênese sitio dirigida, enquanto os outros dois (Y31Fe R103H) foram obtidos através de genes sintéticos. O scFv original e os mutantes foram clonados em vetor pET20b+ e expressos em E.coli C43(DE3), resultando em proteínas solúveis de aproximadamente 30 kDa. A indução foi feita com IPTG. Após a lise bacteriana, o conteúdo foi purificado por IMAC. A presença das mutações desejadas foi confirmada por sequenciamento. A estrutura secundária dos scFvs foi avaliada por dicroísmo circular e se mostrou preservada. Concluímos que tanto o scFv original como os mutantes foram clonados e expressos com sucesso na forma solúvel. Todos os scFvs apresentaram rendimentos similares após a etapa de purificação. Além disto, os scFvs apresentaram estrutura secundária preservada, conforme avaliado por dicroísmo circular.

Localização espacial do processamento das metaloproteinases do veneno botrópico / Spatial location of the processing of snake venom metalloproteinases

The zinc-dependent metalloproteinases include families of proteins with essential function for homeostasis such as MMPs and ADAMs. These enzymes are involved in a wide variety of biological processes ranging from physiological cell proliferation and differentiation to pathological states associated with tumor metastasis, inflammation, tissue degeneration, and cell death. Snake Venom Metalloproteinases (SVMPs) are also zinc-dependent enzymes abundant in venoms of viper snakes. SVMPs are responsible for most local and systemic symptoms of human envenomings. As MMPs and ADAMs, SVMPs are synthesized as zymogens and the enzyme activation is regulated by hydrolysis of its pro-domain. However, very little is known about activation of SVMPs and where the hydrolysis of the pro-domain occurs. In this study, we attempted to identify and quantify the presence of pro-domains in different compartments of snake venom glands as zymogens or at free form, in order to enlighten some mechanism involved in SVMP activation. For this purpose, the prodomain of jararhagin (PD-Jar), a SVMP prevailing in the venom of Bothrops jararaca, was obtained in its recombinant form and used to immunize mice and rabbits to obtain antibodies specific to SVMP pro-domains, which were tested with samples of venom or glands tissues collected in different periods of the venom production cycle. By Western blotting, bands of 22 and 45 kDa, that correspond respectively to free pro-domains or zymogen of P-I SVMPs expected mobilities, were revealed in venom samples collected 4, 7 and 10 days after stimulus of venom production cycle. In venom glands, bands of zymogen molecular masses were detected in tissue extracts all along the cycle, but on the venom collected from the lumen these high molecularmass bands were detected only at the peak of venom production and not at the quiescent state. The antigens recognized by Western blots were immunoprecipitated with anti-PD-Jar and subjected to MS/MS. Pro-domain peptides were identified in all samples together with a few venom proteins that co-precipitated with SVMPs and the Glutamyl Peptide Cyclotransferase, involved in SVMP post-translational processing. In order to identify the location of these molecules within the venom secretory apparatus, gland tissues were submitted to immunofluorescence andimmunoelectronmicroscopy analysis. The results show positive staining of prodomain in secretory cells majorly at the secretory vesicles near the Golgi in the active glands. Taken together, our data shows that processing of SVMPs starts within secretory vesicles of venom gland secretory cells and occurs predominantly at the lumen of the venom gland just after the enzyme secretion. As such, SVMPactivation differs from ADAMs and MMPs, but can be used as a model for studying the relevance of peptides resulting from pro-domain processing and degradation for the control of metalloproteinases activity.

Metaloproteinases incluem famílias de proteínas com funções essenciais para a homeostase em diferentes seres vivos, tais como as MMPs e ADAMs. Estas enzimas estão envolvidas em uma grande variedade de processos biológicos tanto fisiológicos, como proliferação e diferenciação celular, quanto estados patológicos associados com a metástase de tumores, inflamação, degeneração de tecidos e morte celular. Metaloproteinases do veneno de serpentes (SVMPs) também são enzimas dependentes de zinco abundantes em venenos de serpentes. SVMPs são responsáveis pela maioria dos sintomas locais e sistêmicos do envenenamento humano. Tal como as MMPs e ADAMs, as SVMPs são sintetizadas como zimogênios e a ativação da enzima é regulada por meio de hidrólise do seu pródomínio. No entanto, muito pouco se sabe sobre a ativação de SVMPs e onde a hidrólise do pró-domínio ocorre. Neste estudo, buscou-se identificar e quantificar a presença de pró-domínios como zimogênios ou de forma livre em diferentes compartimentos da glândula de veneno, a fim de esclarecer alguns mecanismos envolvidos na ativação da SMVP. Para esta finalidade, o pró-domínio da jararagina (PD-Jar), uma SVMP prevalente no veneno de Bothrops jararaca, foi obtido na sua forma recombinante e usado para imunizar camundongos e coelhos para a obtenção de anticorpos anti-pró- omínio que foram testados com amostras de veneno ou glândulas coletadas em diferentes períodos do ciclo de produção de veneno. Por western blotting, as bandas de 22 e 45 kDa, que correspondem, respectivamente, ao pró-domínio livre e ao zimogênio de SVMP de classe P-I, foram revelados em amostras de veneno coletadas 4, 7 e 10 dias após o estímulo do ciclo de produção de veneno. No veneno coletado a partir do lúmen, bandas de alta massa molecular foram detectadas apenas no pico da produção de veneno e não no estado quiescente. Em glândulas de veneno, foram detectadas predominantemente as bandas de massas moleculares de zimogênios, em tecidos extraídos ao longo do ciclo. Os antígenos reconhecidos por Western blotting foram imunoprecipitados com anticorpo anti-PD-Jar e submetidos a MS/MS. Peptídeos de pró-domínio foram identificados em todas as amostras, juntamente com algumas proteínas do veneno que foram co-precipitadas e também o GPC (glutamyl peptide cyclotransferase), que está envolvido em processamentos pós-traducionais das SMVPs. A fim de identificar a localização destas moléculas no interior da glândula de veneno, os tecidos das glândulas foram submetidos à análise por imunofluorescência e imunoeletromicroscopia. Os resultados mostram a coloração positiva de pró-domínio em células secretoras majoritariamente nas vesículas secretoras perto do Golgi. Tomados em conjunto, os nossos dados mostram que o processamento das SVMPs começa dentro de vesículas secretoras de veneno das células secretoras e ocorre predominantemente no lúmen da glândula de veneno após a secreção das enzimas. Como tal, a ativação das SMVPs difere de ADAMs e MMPs, mas pode ser utilizado como um modelo para o estudo da relevância dos peptídeos resultantes do processamento e degradação do pró-domínio para o controle da atividade de metaloproteinases.

Análise proteômica da variação individual em venenos de filhotes de Bothrops jararaca / Analysis of the individual variation of the venom proteome of Bothrops jararaca newborn specimens

Envenomation by Bothrops snakes cause local damage as well as systemic, hemostatic and cardiovascular effects. Ontogenetic changes and variations related to animal gender, composition and activities of individual adult venoms are features commonly reported in the literature, however, the variation in the composition of newborn snake venom is still unknown. For this study, venom from 21 newborn specimens of B. jararaca was milked and stored at -20°C until use. Protein quantification in the fresh venoms varied among individuals however most of them showed values between 110 and 120 mg/ml. Venom electrophoretic profiles were analyzed under reducing and non-reducing conditions and showed various differential protein bands among the venoms. Glycoprotein staining showed some subtle variations in the individual venom glycoproteomes. Comparison of the venoms by Western blot analysis using an anti-metalloproteinase antibody (anti-bothropasin) showed intense recognition of various protein bands, however their molecular masses varied among the venoms. Likewise, recognition of serine proteinases in the venoms by an anti-serine proteinase antibody (anti MSP1/MSP2) revealed bands of variable molecular masses in newborn venoms. Considering the importance of the proteolytic activity in B. Jararaca accidents, two different substrates were used for measuring this activity: i) casein, a protein that can be degraded by both metalloproteinases and serine proteinases; ii) benzoyl-L arginyl-pNA (L-BAPNA), a synthetic substrate which is only degraded by trypsin-like serine proteinases. The caseinolytic activity did not vary among the venoms, however, individual values of amidolytic activity upon L BAPNA were significantly different among the venoms and some of them did not hydrolyze this substrate. Similarly, the coagulant activity was assessed by the determination of the Minimum Coagulant Dose and showed remarkable variability among the venoms. Analysis of the venoms by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) showed significant differences between some samples, however, an interesting finding was the ubiquitous presence in these venoms of the tripeptide <E-K-W, which is an important inhibitor of venom metalloproteinases. The electrophoretic profiles of proteins submitted to reduction of disulfide bonds showed significant variability among the venoms and identification of proteins by in gel trypsin digestion followed by LC-MS/MS was carried out to identify proteins differentially expressed in the individual newborn venoms. On the other hand, the electrophoretic profiles of venoms analyzed under non-reducing conditions showed less individual variability and the identification of proteins present in a region of the gel which contained a broad protein band present in all venoms revealed the presence of metalloproteinases, L-amino acid oxidase, and amino peptidase as common components of these venoms.

Venenos do gênero Bothrops causam, além de efeitos locais, efeitos sistêmicos sobre os sistemas hemostático e cardiovascular. Mudanças ontogenéticas, além de variações relacionadas ao sexo do animal, na composição individual e atividades dos venenos de adultos, são características frequentemente reportadas na literatura, entretanto, a variação na composição individual de venenos de filhotes de serpentes deste gênero não é conhecida. Para este estudo, o veneno de 21 filhotes de B. jararaca foi extraído e estocado individualmente a -20°C até o uso. A quantificação de proteínas nos venenos variou entre os indivíduos, porém a maioria apresentou valores de 110-120 mg/ml. Os perfis eletroforéticos foram analisados com e sem redução das pontes de dissulfeto das proteínas e diversas diferenças foram visualizadas entre os venenos. O perfil eletroforético dos venenos com coloração para glicoproteínas mostrou sutis diferenças. A análise por Western blot utilizando m anticorpo anti-bothropasina mostrou reconhecimento significativo, porém variável, de bandas contendo metaloproteinases, na maioria dos venenos. Da mesma forma, a análise utilizando o anticorpo anti-MSP1/MSP2, revelou variação com relação às massas moleculares e intensidades das bandas reconhecidas contendo serinoproteinases. Considerando a importância da atividade proteolítica nos envenenamentos, foram utilizados dois substratos diferentes para a determinação dessa atividade: a proteína caseína, que pode ser degradada tanto por serinoproteinases como metaloproteinases e o substrato sintético Lbenzoil-Arginil- NA L-BAPNA) que é degradado somente por serinoproteinases. Valores de atividade caseinolítica específica não apresentaram variação expressiva entre os venenos, porém quanto à atividade amidolítica sobre o substrato L-BAPNA os venenos mostraram significantemente diferentes, e alguns deles não apresentaram atividade enzimática sobre este substrato. Da mesma forma, a atividade coagulante sobre o plasma humano, determinada pela Dose Mínima Coagulante, mostrouse bastante variável entre os indivíduos. A análise dos venenos por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) apresentou diferenças significativas entre algumas amostras, contudo uma característica ubíqua foi a presença do tripeptídeo <EKW em todos os venenos, um importante tripeptídeo, que é inibidor de metaloproteinases. O perfil eletroforético dos venenos, analisados com as proteínas submetidas à redução de pontes de dissulfeto, mostrou significativa variabilidade e a identificação de proteínas por digestão in gel com tripsina seguida de análise por LC-MS/MS foi realizada com o objetivo de identificar proteínas diferencialmente expressas nos venenos individuais de filhotes. Por outro lado, a análise eletroforética comparativa dos venenos em condições nãoredutoras mostrou perfis individuais menos variáveis, quando comparados com a análise com redução, e a identificação de proteínas presentes em uma região do gel, que era semelhante entre os venenos, levou à identificação de metaloproteinases, L-aminoácido- xidase, e aminopeptidase, que seriam toxinas comuns entre eles. Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram a expressiva variabilidade individual nos venenos de filhotes de B. jararaca, fato que já havia sido demonstrado em venenos individuais de adultos desta espécie, e sugerem que a variação individual nos venenos está presente desde o nascimento, não sendo um reflexo da ontogenia do animal. Estes achados servem como subsídios para o entendimento das bases moleculares da variabilidade de venenos de serpentes, sobretudo da B. jararaca.

Caracterização das microvesículas presentes no veneno de Crotalus durissus terrificus / Caracterization of the microvescles present in Crotalus durissus terrificus venom

The Crotalus durissus terrificus (Cdt) venom is constituted by toxins that are responsible for the clinical complications caused by envenoming. These toxins are not the only components presents in the venom; numerous electron-dense microvesicles (40 – 80 nm in diameter) are observed on the luminal face of secretory cells of venom gland and in the venom of Cdt. This microvesicles originate from microvilli by fragmentation or membrane budding and have intramembranous particles on the cytoplasmic leaftet, suggesting the presence of transmembrane proteins. The aim of this study was to identify and characterize specific proteins in the microvesicles from Cdt venom. The venom used was manually extracted from Cdt snakes maintained in the Laboratory of Herpetology at Instituto Butantan. The microvesicles were isolated by ultracentrifugation. Supernatant (S2) from the first ultracentrifugation, venom without microvesicles, and crude venom were used as controls. Morphological analysis showed that after two ultracentrifugations the microvesicles kept their morphology. One-dimensional electrophoresis assay showed band of approximately 72, 148, 176, 272 and 323 kDa that were present only in the microvesicle extract. Analysis of two-dimensional electrophoresis confirms the presence these specific microvesicle proteins. When S2 was used as a control, 18 spots were detected only in microvesicle extract. These spots are: 1) approximately 180 kDa with pI around 4; 2) ranging from 60 to 70 kDa with pI ranging from 7 to 9; 3) 11 kDa with PI 4; 4) approximately 10 kDa with pI ranging from 5 to 7 or 9 to 10. However, when fresh crude venom was used as a control, besides the 18 spots, 10 more spots were detected in S2 and microvesicle extract that is not present in the crude venom (spots of 36 kDa and pI ranging from 5 to 7 and spots of 32 kDa and pI ranging from 9 to 10). Western Blotting analysis showed that the Crotalus antivenom recognize only some microvesicle proteins. The identification of proteins by mass spectrometry showed the presence of cellular membrane and intracellular proteins. Identified membrane cellular proteins are ecto-5´nucleotidase, aminopeptidase N and angiotensin-converting enzyme-like. Identified intracellular proteins are Ankyrin repeat domain-containing protein 62, N-acylglucosamine 2-epimerase, leucine-rich repeat, immunoglobulin-like domain and transmembrane,domain-containing protein 3 DNA fragmentation factor subunit alpha isoform 1, protein phosphatase 1 regulatory subunit 26. In conclusion, we showed that after ultracentrifugations the microvesicles kept their morphology, but some of them seem to be lysed since 10 spots were found only in S2 and microvesicles extract, but not in the crude venom. Besides, the protein identified could have a role in metabolic pathways that regulates the integrity of the secretory cells. In addition, these proteins could have a relevant role in envenoming according to their functions described in the literature. The participation of the microvesicles in pathophysiology process shows its importance and open new avenues towards an understanding of their role in the envenoming.

O veneno de Crotalus durissus terrificus (Cdt), é constituído por toxinas responsáveis pelas complicações clínicas que ocorrem durante o envenenamento, entretanto, estas toxinas não são os únicos componentes presentes no veneno, numerosas microvesículas de conteúdo elétron-denso (40-80 nm de diâmetro) são observadas na face luminal das células secretoras da glândula de veneno, bem como no veneno coletado. Estas estruturas originam-se de microvilos por fragmentação ou brotamento e possuem partículas intramembranosas na face citoplasmática sugerindo a presença de proteínas transmembrânicas. O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar as proteínas presentes nas microvesículas do veneno de Cdt, correlacionando suas possíveis funções através de dados já conhecidos na literatura. Em nossos estudos, utilizamos veneno extraído de Cdt, mantidas em cativeiro no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan. Isolamos as microvesículas do veneno de Cdt através de ultracentrifugações. O Sobrenadante (S2) da primeira ultracentrifugação, veneno sem microvesículas, e o veneno bruto foram utilizados como controles. A análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão mostrou que a morfologia das microvesículas se mantém mesmo após as duas ultracentrifugações. Em eletroforese unidimensional detectamos bandas em torno de 72, 148, 176, 272 e 323 kDa que estão presentes somente no extrato de microvesículas. A análise do perfil protéico em eletroforese bidimensional confirmou a presença de proteínas específicas de microvesículas. Quando S2 foi utilizado como controle, 18 spots foram detectados somente no extrato de microvesículas (spots de180 kDa com pI em torno de 4; spots entre 60 a 70 kDa com pI em torno de 7 a 9; spots de 11 kDa com pI 4; spots de 10 kDa com pI entre 5 a 7 e 9 a 10). Entretanto, quando o veneno bruto foi utilizado como controle, mais 10 spots foram detectados em S2 e extrato de microvesículas (spots de 36 kDa e pI em torno de 5 a 7 e spots de 32 kDa e pI em torno de 9 a 10). A análise por Western blotting, utilizando soro anticrotálico como fonte de anticorpos, mostrou que somente algumas proteínas das microvesículas são reconhecidas. As identificações das proteínas, por espectrometria de massa, mostraram a presença de proteínas de membrana celular e proteínas intracelulares. As proteínas de membrana celular identificadas foram: ecto-5´-nucleotidase, aminopeptidase N e enzima conversora de angiotensina. As proteínas intracelulares identificadas foram: proteína contendo domínios de anquirina, N-acylglucosamine 2-epimerase, proteína com domínios ricos em leucina, domínio imunoglobulina e domínio transmembrânico, isoforma 1 da subunidade alfa do fator de fragmentação de DNA e subunidade regulatória da fosfatase 1. Em conclusão, mostramos que após as ultracentrifugações, as microvesículas mantêm sua morfologia, mas algumas delas são lisadas, visto que mais 10 spots foram identificados em S2 e extrato de microvesículas, mas não no veneno bruto. Além disso, as proteínas identificadas podem fazer parte de vias metabólicas que regulam a integridade da célula secretora bem como ter um papel relevante no envenenamento, de acordo com as funções já descritas em literatura. A participação de microvesículas em processos fisiológicos ou patológicos mostra sua importância e abre novas perspectivas de investigação de seu papel no envenenamento.

Proteômica e transcriptômica aplicadas ao estudo da variabilidade do veneno Bothrops jararaca ( Serpentes Viperidae) / A proteomics and transcriptomics applied to the study of Bothrops jararaca venom variability ( Serpentes viperidae)

Estudos prévios demonstram que as atividades biológicas do veneno da serpente Bothrops jararaca sofrem significantes modificações ontogenéticas. Neste estudo é apresentada uma análise comparativa do proteoma, peptidoma e transcriptoma da glândula de veneno de filhotes e adultos de B. jararaca, correlacionando os resultados obtidos com algumas catacterísticas funcionais dos venenos...

Previous studies have demonstrated that the biological activities displayed by the venom of snake Bothrops jararaca undergo a significant ontogenic shift. In this investigation, we performed comparative proteomic, peptidomic and transcriptomic analyses of venoms and venom glands from newborn and adult specimens of B. jararaca and correlated the results with the evaluation of functional venom features...

Proteômica e transcriptômica aplicadas ao estudo da variabilidade do veneno de Bothrops jararaca (serpentes:viperidae) / Proteomics and transcriptomics applied to the study of Bothrops jararaca venom variability (Serpentes: Viperidae)

Estudos prévios demonstraram que as atividades biológicas do veneno da serpente Bothrops jararaca sofrem significantes modificações ontogenéticas. Neste estudo é apresentada uma análise comparativa do proteoma, peptidoma e transcriptoma da glândula de veneno de filhotes e adultos de B. jararaca, correlacionando os resultados obtidos com algumas características funcionais dos venenos. Venenos de 694 filhotes de até duas semanas de idade e 110 adultos, provenientes do Estado de São Paulo foram extraídos e liofilizados para as análises proteômicas/peptidômicas e funcionais. O mRNA de glândulas de veneno de 20 filhotes e 10 adultos foi obtido para a contrução de bibliotecas de cDNA e a análise de Expressed Sequence Tag (ESTs). Demonstramos que a atividade hemorrágica é similar para os venenos de filhotes e adultos, enquanto que o veneno de adultos é discretamente mais letal para camundongos; entretanto, o veneno de filhotes mostrou-se extremamente mais letal para aves, uma característica que pode garantir proteção contra potenciais predadores nas fases iniciais de vida da espécie. A atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de 10 vezes mais alta que aquela verificada para o veneno de adultos e é atribuída sobretudo à atividade de metaloproteinases. Essas diferenças nas atividades funcionais se refletiram nos diferentes perfis verificados por eletroforese bidimensional e identificação de spots de proteínas por digestão tripsínica in-gel seguida de análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem, zimografia com gelatina, imunocoloração utilizando anticorpos específicos anti-proteinases, e glicoproteínas com afinidade pela concanavalina -A. A comparação dos venenos por derivatização com tags isóbaros (iTRAQ) e a análise das ESTs revelaram diferenças claras entre os níveis de toxinas presentes nos venenos e as metaloproteinases foram a classe de toxinas mais expressa, além de serem as toxinas cujos perfis estruturais ...

Previous studies have demonstrated that the biological activities displayed by the venom of the snake Bothrops jararaca undergo a significant ontogenetic shift. In this investigation, we performed comparative proteomic, peptidomic and transcriptomic analyses of venoms and venom glands from newborn and adult specimens of B. jararaca and correlated the results with the evaluation of functional venom features. Venoms from 694 two-week old newborns and 110 adults from São Paulo state were milked and lyophilized for functional and proteomic/peptidomic analyses. Additionally, mRNA was obtained from the venom glands of 20 newborns and 10 adults and used for the construction of cDNA libraries and Expressed Sequence Tag (ESTs). We demonstrate that newborn and adult venoms have similar hemorrhagic activities, while the adult venom has a slightly higher lethal activity upon mice; however, the newborn venom is extremely more potent to kill chicks, a feature that might ensure protection against potential predators in early stages of B. jararaca life. Interestingly, the coagulant activity of the newborn venom upon human plasma is ten times higher than that of the adult venom and is contributed mainly by metalloproteinases. Differences in functional activities were clearly reflected in the venom different profiles of two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and protein spot identification by in-gel trypsin digestion followed by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gelatin zimography, immunostaining using specific anti-proteinase antibodies, and concanavalin A-binding proteins. The venom comparison by isobaric tag peptide labeling (iTRAQ) and ESTs analysis revealed clear differences in toxin levels. The metalloproteinases were detected as the toxin class most expressed in the venoms in addition to being the toxins whose structural profile most changed, as illustrated by the ratio P-III/P-I class being higher in newborn venoms. Sexual ...