MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ALTERNATIVOS: REVISIÓN DEL PROCESO DE VALIDACIÓN PARA LA IMPLEMENTACIÓN EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA / Alternatives microbiological methods: review of the validation process for the implementation in the pharmaceutical industry

Los métodos clásicos o tradicionales utilizados para el control microbiológico de medicamentos fueron desarrollados hace más de un siglo y se continúan utilizando ya que cumplen con su función de enumerar e identificar microorganismos, contribuyendo a controlar la seguridad microbiológica de los productos farmacéuticos. Estos métodos, tienen la principal desventaja de requerir prolongados tiempos de incubación por lo que, con la intención de resolver este punto y otras limitaciones, se desarrollaron nuevas tecnologías con distintas estrategias para la detección microbiana. El objetivo del presente trabajo fue analizar y discutir acerca de los procesos de validación de métodos microbiológicos alternativos y su implementación en el control de calidad de productos farmacéuticos. Las tecnologías utilizadas en los métodos microbiológicos alternativos pueden clasificarse en detección temprana basada en la actividad metabólica, medición directa de células, o basados en la medición de biomoléculas. Los parámetros críticos a evaluar son exactitud, precisión, especificidad, límite de detección y cuantificación, linealidad y rango, robustez y equivalencia; su determinación dependerá de la categoría del ensayo: cualitativo/cuantitativo. Las guías analizadas presentan lineamientos generales sobre el análisis de estos atributos, evidenciándose leves diferencias en la terminología, procedimientos de validación, interpretación de datos, criterios de aceptación y uso de métodos estadísticos. Según surge de la revisión realizada, se destaca el requisito de contar con procedimientos de ensayo detallados, con el fin de establecer los atributos de validación para productos farmacéuticos

The traditional methods used for the microbiological quality control of medicines were developed more than a century ago and they continue being used since they fulfill the role to enumerate and identify microorganisms, providing microbiological safety of pharmaceutical products. These methods have the main disadvantage of requiring long incubation times, therefore, with the intention of solving this point and other limitations, new technologies were developed. The objective of this work was to analyze and discuss the validation processes of alternative microbiological methods and their implementation in the quality control of pharmaceutical products. The technologies used in alternative microbiological methods can be classified as: early detection based on metabolic activity, direct measurement of cells, or based on the measurement of biomolecules. The critical parameters to evaluate are accuracy, precision, specificity, limit of detection and quantification, linearity and range, robustness and equivalence; its determination will depend on the category of the assay: qualitative / quantitative. The consulted bibliography presents general guidelines on the analysis of these attributes, showing slight differences in terminology, validation procedures, data interpretation, acceptance criteria and use of statistical methods. To summarize, this review highlights the importance of using detailed test procedures, in order to establish the validation attributes for pharmaceutical products.

Cumplimiento de normas microbiológicas en productos alimenticios comercializados en la red de mercados de alimentos del estado Nueva Esparta, Venezuela (período 2006-2014) / Compliance of microbiological norms in food products commercialized in the markets of Nueva Esparta state, Venezuela during the years 2006 to 2014

El suministro de suficientes alimentos es prioritario para garantizar la seguridad alimentaria de una población. También es importante corroborar que sean de calidad e inocuos, para que no causen daño al consumirlos cuando se preparen de acuerdo al uso previsto. Esta investigación verifica si 101 lotes (370 unidades de muestra) de alimentos envasados (harina de maíz, leche en polvo, pasta alimenticia, mortadela, salchicha cocida, carne congelada, pollo congelado, leche UHT, atún enlatado y carne de almuerzo) comercializados en el Estado Nueva Esparta durante los años 2006 a 2014, cumplían requisitos microbiológicos indicados por normas venezolanas. Las muestras fueron captadas por Inspectores de Salud Pública (MPPS). Para los análisis se aplicaron procedimientos de normas COVENIN y FONDONORMA. Cumplieron los requisitos considerados todas las muestras de pasta alimenticia, mortadela, pollo congelado, atún en conserva y carne de almuerzo. Sin embargo, dos lotes de leche UHT y otros dos de carne congelada presentaron recuentos de aerobios mesófilos superiores a las estipulaciones en alguna de las unidades analizadas. Por otra parte, tres de los nueve lotes de salchichas cocidas incumplieron alguno de los requisitos con carácter de recomendación, igualmente 5 de los 16 lotes de harina de maíz (recuentos de mohos) y 10 de los 17 de leche en polvo (recuentos de esporas termófilas). Se concluye que estos incumplimientos pudieran estar ocasionados por fallas de control durante la cadena de producción, re-envasado, almacenamiento o comercialización bien sea de materias primas o de productos terminados.

Enough food supply is a priority to guarantee the food security of a country´s residents. It is also important to supervise that they are harmless for human consumption. This study verifies if 370 packed foods (corn flour, powdered milk, spaghetti, bologna, frozen meat and chicken, pork sausage, UHT milk, canned tuna and luncheon meat), that belonged to 101 production lots commercialized during the years 2006 to 2014 in Nueva Esparta state (Venezuela), fulfill microbiological specifications indicated by Venezuelan norms. Samples were picked up by public health inspectors. For analysis the COVENIN and FONDONORMA procedures were used. All the spaghetti, bologna, frozen chicken, canned tuna and luncheon meat samples complied with the norms. Nevertheless, two UHT milk´s production lots and other two of frozen meat showed total aerobic plate counts higher than the recommended limits. By the other hand, 9 pork sausage´s production lots failed to fulfill a few norms, just as 5 of 16 corn flour lots (molds counts), and 10 of 17 powdered milk production lots (thermophiles spore counts). In conclusion, the nonfulfillment of norms detected, particularly in corn flour and powdered milk samples, are caused by not performing proper controls during the production chain and commercialization of raw materials or finished products.

Detección de Listeria monocytogenes en queso blanco criollo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) / Detection of Listeria monocytogenes in white cheese by Polymerase Chain Reaction (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR, es un método que permite replicar miles de veces, en pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. La aplicación de métodos rápidos y sensibles, para detectar Listeria monocytogenes en muestras de queso blanco, permitirá un mejor control microbiológico del proceso de producción. Se aplicó PCR a 30 muestras de queso blanco, de una quesera de Valencia Estado Carabobo. Se detectó especificidad y sensibilidad para PCR mediante el empleo de la cepa control Listeria monocytogenes 446. Extracción de ADN según metodología descrita por Torres y col., Marcador de peso molecular de 100 pares de base. Se emplearon: cuatro cebadores del gen hlyA de listeriolisina O; iniciadores L1/U1 para banda 938 pb y LF/LR para banda 750 pb del gen hlyA. Estadístico EpiInfo V6 para concordancia de observaciones en geles, mediante coeficiente Kappa (K). Resultados: 8 de las 30 muestras de queso analizadas, mostraron crecimiento presuntivo de Listeria spp en Agar PALCAM. De las cuales 2 de las muestras no pertenecian al género Listeria; en las 6 restantes las pruebas de confirmación arrojaron que: 2 eran L. monocytogenes, 3 L.ivanovii y 1 L. seeligeri. Mediante PCR 2 muestras resultaron positivas para L. monocytogenes al amplificar la banda 938 pb para Listeria y banda 750 pb para la especie monocytogenes. Se concluye que PCR demostró ser altamente específico y sensible para L. monocytogenes, teniendo ventaja sobre agar PALCAM al evidenciar la presencia especifica del patógeno en un tiempo relativamente corto.

The Polymerase Chain Reaction, known as PCR, is a method to replicate thousands of times within a few hours and in vitro, small amounts of DNA. The application of rapid and sensitive methods to detect Listeria monocytogenes in cheese samples, allow a better microbiological control of the production process. PCR was applied to 30 samples of of white cheese, from Valencia, Carabobo State. It was detected PCR specificity and sensitivity by using the control strain Listeria monocytogenes 446. DNA extraction according to the methodology described by Torres et al., Molecular weight marker 100 base pairs. Were used: four primers hlyA gene of listeriolysin O; L1/U1 primers for 938 bp band and LF / LR 750 bp band hlyA gene. EpiInfo Statistical V6 to match observations in gels, by Kappa coefficient (K). Results: 8 out of 30 cheese samples analyzed showed presumptive growth of Listeria spp in PALCAM Agar. Two of the samples not belonged to the genus Listeria, in the 6 remaining sample confirmation tests showed that: 2 were L. monocytogenes, 3 L. ivanovii and 1 L. seeligeri. In PCR 2 samples were positive for L. monocytogenes by amplify the 938 bp band for Listeria and 750 bp band for the species monocytogenes. We concluded that PCR was highly specific and sensitive to L. monocytogenes, taking advantage of PALCAM agar to detect the presence of the pathogen specifies a relatively short time.

Frecuencia de listeria monocytogenes en muestras de tomates (lycopersicum esculentum) y cilantro (coriandrum sativum) frescos en tres supermercados de Valencia, Venezuela / Prevalence of listeria monocytogenes in fresh tomatoes (lycopersicum esculentum) and coriander (coriandrum sativum) in three markets of Valencia, Venezuela

Se determinó la frecuencia de L. monocytogenes en tomates y cilantro, de tres diferentes supermercados, ubicados en el Municipio Valencia, Estado Carabobo, durante ocho semanas. Se evaluaron 192 muestras: 96 de tomates y 96 de cilantro. Procesamiento y análisis microbiológico, según Normas Industriales COVENIN 3718:2001. Paquete estadístico SPSS versión 12.0. Se aplicó prueba de Kolmogorov Smirnov, test de U Mann Whitney y Kruskal Wallis y correlación de Spearman. Nivel de significancia (pListeria spp para tomates y cilantro, durante las ocho semanas de recolección en los tres supermercados; ni tampoco entre las distribuciones de NMP en tomates y cilantro de los tres supermercados (Chi²=5,233 p2=1,624 p2=6,547 p2=2,667 pListeria spp en tomate fue 41,66 por ciento (25,0 por ciento L. monocytogenes y 16,7 por ciento L. ivanovii); en cilantro 77,08 por ciento (36,5 por ciento L. monocytogenes, 33,3 por ciento L. ivanovii, 7,3 por ciento L. seeligeri). Se concluye que el elevado porcentaje encontrado de L. monocytogenes en tomates y cilantro, es independiente del supermercado de expendio; se evidencia la necesidad de un control microbiológico a nivel del sistema de riego, recolección y distribución, para asegurar la calidad del producto.

The incidence of L. monocytogenes in tomatoes and coriander obtained from three different markets, during eight weeks were determined. 192 samples were evaluated: 96 of tomatoes, and 96 of coriander. The isolation of L. monocytogenes was performed using COVENIN 3718:2001. The data were analyzed by SPSS version 12.0. Kolmogorov Smirnov, Mann Whitney U, Kruskal Wallis U test; Spearman’s correlation were applied, and pListeria spp to tomatoes and coriander during the eight weeks of recollection in the markets; neither between the distributions of MPN of tomatoes and coriander from the markets (Chi²=5,233 p2=1,624 p2=6,547 p2=2,667 pL. monocytogenes and 16,7 percent L. ivanovii); in coriander 77,08 percent (36,5 percent L. monocytogenes, 33,3 percent L. ivanovii and 7,3 percent L. seelige.). We concluded that the high level of L. monocytogenes in tomatoes and coriander is independent of the markets store; we see the necessity of a microbiological control on the irrigation system, collection and distribution to ensure the quality of the product.