Estudo de linhagens de leveduras Saccharomyces cerevisiae oriundas da biodiversidade ambiental na fermentação alcoólica / Study of yeast strains Saccharomyces cerevisiae from biodiversity environmental in alcoholic fermentation

Linhagens de leveduras Saccharomyces cerevisiae, nativas e oriundas do processo industrial de produção de etanol foram isoladas e comparadas com a levedura padrão CAT-1, selecionada e amplamente utilizada na indústria de etanol, em sistema descontínuo de fermentação, com reciclo celular. As linhagens foram reativadas em meio sólido de manutenção em placas de Petri e em seguida foram colocadas em crescimento em meio de caldo de cana-deaçúcar clarificado e diluído à 4º Brix. Após a obtenção da massa celular, na concentração de 1,0 x 108 cél./mL, as linhagens foram inoculadas em meio de caldo de cana-de-açúcar a 20º Brix e assim procedeu-se por seis ciclos fermentativos consecutivos. Ao final de cada ciclo procedeu-se as determinações do teor de etanol, pH, produção de biomassa, viabilidade e concentração de células, açúcares redutores totais residuais no vinho e acidez. Com os resultados obtidos foram calculados a eficiência fermentativa, viabilidade celular e brotamento. Os dados foram analisados estatisticamente utilizando-se a análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os resultados mostram que a linhagem utilizada em processo industrial, a CAT-1, se destacou diante das duas linhagens isoladas e selecionadas (18 e 19) em relação à eficiência fermentativa, mostrando um bom desempenho no processo de fermentação para a produção de etanol. Por outro lado observou-se que as linhagens 18 e 19 apresentaram desempenho fermentativo semelhante e, de modo geral, características adequadas à produção de etanol.

Native strains of Saccharomyces cerevisiae from the industrial ethanol process were isolated and have been tested with standard CAT-1 strain, which was selected, and widely used in ethanol production in southest of Brazil in batch fermentation system with cells recycles (Melle-Boinot). The strains were reactivated in synthetic culture media and then inoculated into clarified sugar cane juice at 4° Brix for growth until it reaches a cell concentration 1.0 x 108/mL. After this, the cells were inoculated in a sugar cane juice at concentration 20°Brix by six fermentative cycles. After each cycle were carried out the following analyses: ethanol concentration, pH, biomass, viability and budding cells. The data were analyzed statistically using variance analyses (ANOVA) and averages compared by Tukey test at 5% probability. The results show the best performance for that CAT-1 in fermentative efficiency than strains 18 and 19, mainly by the ethanol concentration. The 18 and 19 strains showed similar results of performance with characteristics for the ethanol production.

Damages of spittlebug on sugarcane quality and fermentation process

The quality of the raw material defines the industrial potential production. The harvest of raw sugarcane promoted a favorable environment for the increase of Mahanarva fimbriolata (Stål, 1854) pest that affects the plant development. This research was undertaken to evaluate the effects of M. fimbriolata on sugarcane quality and fermentation process. For the technological analysis, four damage levels and two evaluation periods were evaluated, while four fermentation cycles and two evaluation periods were tested for microbiological analysis, with three replications. The determined parameters were Brix (soluble solids), Pol (apparent sucrose), Purity, reducing sugars (RS), total reducing sugars (TRS), Total Acidity, pH and Total Phenolic Compounds in juice. In the fermentation process cellular viability analysis, yeast sprout and bacterial concentration were carried out. The wine was submitted to alcohol content, TRRS (total residual reducing sugars) and fermentation efficiency. The treatment with 60% of damage steams exhibited the lowest averages of Brix, Pol, Purity and TRS of the juice. An increase of the RS% of the juice and content of total phenolic compounds was observed. The cellular and sprouts viability were reduced with the increase in the damages caused by M. fimbriolata. The fermentation process exhibited larger quantities of contaminators. With the damages, the wine TRRS quantity was superior and, consequently there was a decrease of the alcoholic content and fermentation efficiency. The damages caused by M. fimbriolata affected the quality of the raw material, compromising the fermentative process, and increase the production of phenolic compounds and contaminators.

A qualidade da matéria-prima define o potencial de produção da indústria. A colheita de cana sem queima proporcionou um ambiente favorável ao aumento da infestação da Mahanarva fimbriolata (Stål, 1854), que suga a planta e afeta seu desenvolvimento. Avaliaram-se os danos promovidos pela M. fimbriolata na qualidade da cana e no processo fermentativo. Os tratamentos utilizados foram quatro níveis de danos e duas épocas de avaliações para as análises tecnológicas, e quatro níveis de danos, quatro ciclos fermentativos e duas épocas de avaliações para as análises microbiológicas com três repetições. Foram determinados Brix (sólidos solúveis), Pol (sacarose aparente), Pureza, açúcar redutor total (ART), açúcar redutor (AR), Acidez Total, pH, e teor de compostos fenólicos totais no caldo. No processo fermentativo foram realizadas análises de viabilidade celular, brotos de leveduras e concentração de bactérias. Determinaram-se açúcar redutor residual Total (ARRT), teor alcoólico nos vinhos e a eficiência da fermentação. Os tratamentos com 60% dos colmos danificados apresentaram menor média de Brix, Pol, Pureza e ART do caldo. Verificou-se aumento do AR% caldo e dos teores de compostos fenólicos totais. A viabilidade celular e de brotos foram reduzidas com o aumento dos danos provocados pela M. fimbriolata. O processo fermentativo apresentou maiores quantidades de contaminantes. Com os danos a quantidade de ARRT dos vinhos foi maior, houve redução do teor alcoólico, assim como na eficiência da fermentação. Os danos causados pela M. fimbriolata afetaram a qualidade da matéria-prima, comprometendo o processo fermentativo, além de aumentar a produção de compostos fenólicos e contaminantes.

Damages of spittlebug on sugarcane quality and fermentation process

The quality of the raw material defines the industrial potential production. The harvest of raw sugarcane promoted a favorable environment for the increase of Mahanarva fimbriolata (Stål, 1854) pest that affects the plant development. This research was undertaken to evaluate the effects of M. fimbriolata on sugarcane quality and fermentation process. For the technological analysis, four damage levels and two evaluation periods were evaluated, while four fermentation cycles and two evaluation periods were tested for microbiological analysis, with three replications. The determined parameters were Brix (soluble solids), Pol (apparent sucrose), Purity, reducing sugars (RS), total reducing sugars (TRS), Total Acidity, pH and Total Phenolic Compounds in juice. In the fermentation process cellular viability analysis, yeast sprout and bacterial concentration were carried out. The wine was submitted to alcohol content, TRRS (total residual reducing sugars) and fermentation efficiency. The treatment with 60% of damage steams exhibited the lowest averages of Brix, Pol, Purity and TRS of the juice. An increase of the RS% of the juice and content of total phenolic compounds was observed. The cellular and sprouts viability were reduced with the increase in the damages caused by M. fimbriolata. The fermentation process exhibited larger quantities of contaminators. With the damages, the wine TRRS quantity was superior and, consequently there was a decrease of the alcoholic content and fermentation efficiency. The damages caused by M. fimbriolata affected the quality of the raw material, compromising the fermentative process, and increase the production of phenolic compounds and contaminators.

A qualidade da matéria-prima define o potencial de produção da indústria. A colheita de cana sem queima proporcionou um ambiente favorável ao aumento da infestação da Mahanarva fimbriolata (Stål, 1854), que suga a planta e afeta seu desenvolvimento. Avaliaram-se os danos promovidos pela M. fimbriolata na qualidade da cana e no processo fermentativo. Os tratamentos utilizados foram quatro níveis de danos e duas épocas de avaliações para as análises tecnológicas, e quatro níveis de danos, quatro ciclos fermentativos e duas épocas de avaliações para as análises microbiológicas com três repetições. Foram determinados Brix (sólidos solúveis), Pol (sacarose aparente), Pureza, açúcar redutor total (ART), açúcar redutor (AR), Acidez Total, pH, e teor de compostos fenólicos totais no caldo. No processo fermentativo foram realizadas análises de viabilidade celular, brotos de leveduras e concentração de bactérias. Determinaram-se açúcar redutor residual Total (ARRT), teor alcoólico nos vinhos e a eficiência da fermentação. Os tratamentos com 60% dos colmos danificados apresentaram menor média de Brix, Pol, Pureza e ART do caldo. Verificou-se aumento do AR% caldo e dos teores de compostos fenólicos totais. A viabilidade celular e de brotos foram reduzidas com o aumento dos danos provocados pela M. fimbriolata. O processo fermentativo apresentou maiores quantidades de contaminantes. Com os danos a quantidade de ARRT dos vinhos foi maior, houve redução do teor alcoólico, assim como na eficiência da fermentação. Os danos causados pela M. fimbriolata afetaram a qualidade da matéria-prima, comprometendo o processo fermentativo, além de aumentar a produção de compostos fenólicos e contaminantes.

Ethanolic fermentation of sucrose, sugarcane juice and molasses by Escherichia coli strain ko11 and Klebsiella oxytoca strain P2

Escherichia coli KO11 and Klebsiella oxytoca P2 recombinants fermented sucrose to ethanol. In minimal medium with 2% or 12% added sucrose KO11 produced 75% and 41%, respectively, of the maximum theoretical yield (0.54g ethanol/g sucrose). In Luria-Bertani (LB) broth with up to 8% sucrose, KO11 presented a 94-96% yield and with 12% sucrose, KO11 presented about 69% yield (44.5g ethanol/L). P2 presented 55% of the theoretical maximum yield in minimal medium supplemented with 2% sucrose and 47% of the maximum in 12% sucrose. In LB broth with 2 or 4% sucrose, P2 presented 94-95% of the theoretical maximum yield, which fell to 73% with 8% added sucrose (31.4g ethanol/L) and 58% with 12% sucrose (37.5 g/L). Volumetric productivity in LB broth containing 2% sucrose was 0.41 g/L/h for KO11 and 1.1 g/L/h for P2, while in LB broth with 12% added sucrose, productivity was 0.96 g/L/h (KO11) and 1.4 g/L/h (P2). During fermentation of sugar cane juice by E. coli KO11 and K. oxytoca P2 produced 39.4 g/L and 42.1 g/L ethanol when supplemented with 0.5% yeast extract, micronutrients and thiamine. In sugar cane juice supplemented with LB broth ingredients, KO11 ethanol fermentation was inhibited with production of only 23.0 g ethanol/L, while P2 produced 44.2 g/L. Ethanol production by KO11 and P2, respectively, in sugarcane juice was a) 25.3 and 30.2 g/L with 0.2% ammonium sulfate, b) 24.9 and 31.6 g/L with ammonium sulfate and micronutrients, c) 25.6 and 37.5 g/L with ammonium sulfate, micronutrients and thiamine. During molasses fermentation E. coli KO11 presented low ethanol production and high lactic acid production. K. oxytoca P2 produced 25 g ethanol/L in molasses diluted 10-fold in water, with or without addition of 0.5% yeast extract, and 27.8 g/L with addition of LB broth ingredients after 96h. P2 produced 24.5, 26.9, and 28.0 g ethanol/L in molasses diluted 10-fold in vinasse, vinasse with 0.5% added yeast extract and with LB broth ingredients, respectively.

As bactérias recombinantes Escherichia coli KO11 e Klebsiella oxytoca P2 fermentaram sacarose a etanol. Em meio mínimo com 2% ou 12% de sacarose, KO11 apresentou, respectivamente, 75% e 41% do rendimento máximo teórico (0,54g de etanol/g de sacarose). No caldo Luria-Bertani (LB) com até 8% de sacarose, KO11 apresentou rendimento de aproximadamente 94-96% e com 12% de sacarose, KO11 apresentou cerca de 69% de rendimento (44,5g de etanol/L). A porcentagem do rendimento máximo teórico obtida com P2 em meio mínimo com 2% de sacarose foi de 55% e com 12% de sacarose foi de 47%. Em LB com 2 ou 4% de sacarose, P2 apresentou 94-95% do rendimento máximo teórico, porém somente cerca de 73% com 8% de sacarose (31,4g de etanol/L) e 58% com 12% de sacarose (37,5 g/L). A produtividade volumétrica em LB contendo 2% de sacarose foi de 0,41 g/L/h para KO11 e de 1,1 g/L/h para P2, enquanto que em LB com 12% de sacarose, a produtividade foi 0,96 g/L/h (KO11) e 1,4 g/L/h (P2). Durante a fermentação do caldo de cana, E. coli KO11 e K. oxytoca P2 produziram, respectivamente, 39,4 g de etanol/L e 42,1 g/L quando suplementado com 0,5% de extrato de levedura, micronutrientes e tiamina. No caldo de cana suplementado com os reagentes do meio LB, KO11 apresentou forte inibição da fermentação alcoólica, produzindo apenas 23,0 g de etanol/L, enquanto que P2 produziu 44,2 g/L. A produção de etanol por KO11 e P2, no caldo de cana suplementado com a) 0,2% de sulfato de amônio foi, respectivamente: 25,3 e 30,2 g/L, b) com sulfato de amônio e micronutrientes: 24,9 e 31,6 g/L, c) com sulfato de amônio, micronutrientes e tiamina: 25,6 e 37,5 g/L. Durante a fermentação do melaço, E. coli KO11 apresentou baixa produção de etanol e alta produção de ácido láctico. K. oxytoca P2 produziu 25 g de etanol/L a partir de melaço diluído 10X em água, com ou sem adição de 0,5% de extrato de levedura e 27,8 g/L com reagentes do caldo LB após 96h. P2 produziu 24,5, 26,9, e 28,0 g de etanol/L em melaço diluído 10X em vinhoto, vinhoto com 0,5% de extrato de levedura e com os reagentes do caldo LB, respectivamente.

'Killer' character of yeasts isolated from ethanolic fermentations

The number of killer, neutral and sensitive yeasts was determined from strains isolated from substrates related to alcoholic fermentations. From 113 isolates, 24 showed killer activity against NCYC 1006 (standard sensitive strain), while 30 were sensitive to NCYC 738 (standard killer strain), and 59 had no reaction in assays at 25-27°C. Two wild yeast strains of Saccharomyces cerevisiae and one of Candida colliculosa were tested against 10 standard killer strains and one standard sensitive strain in a cell x cell and well-test assays at four different pHs. None of the isolates displayed strong killer activity or were sensitive to the standard strains. All belonged to the neutral type. It was concluded that although the number of killer strains was high, this character cannot be used to protect ethanol fermentation processes against yeast contaminants like those which form cell clusters.

Avaliou-se o número de linhagens 'killer', sensíveis e neutras em leveduras isoladas de substratos relacionados à fermentação etanólica. Das 113 linhagens, 24 mostraram atividade 'Killer' contra o isolado NCYC 1006 (padrão de sensibilidade), 30 foram sensíveis ao isolado NCYC 738 (padrão 'Killer') e 59 apresentaram reação neutra para ambos os isolados. Três cepas de leveduras selvagens do processo (duas de Sacch. cerevisiae e uma de Candida colliculosa, que formam cachos de células não separáveis por tratamentos químicos ou físicos), foram testadas contra 10 isolados padrões do tipo 'Killer' e um isolado padrão de sensibilidade. Os ensaios células x células e células X toxinas foram realizados em diferentes pH e a 30ºC. As três cepas contaminantes mostraram reação neutra a todos os isolados padrões testados. Apesar do alto número de linhagens 'Killer' entre aquelas testadas, concluiu-se que este caráter não pode ser utilizado na proteção do processo de fermentação etanólica contra essas leveduras selvagens contaminantes.

'Killer' character of yeasts isolated from ethanolic fermentations

The number of killer, neutral and sensitive yeasts was determined from strains isolated from substrates related to alcoholic fermentations. From 113 isolates, 24 showed killer activity against NCYC 1006 (standard sensitive strain), while 30 were sensitive to NCYC 738 (standard killer strain), and 59 had no reaction in assays at 25-27°C. Two wild yeast strains of Saccharomyces cerevisiae and one of Candida colliculosa were tested against 10 standard killer strains and one standard sensitive strain in a cell x cell and well-test assays at four different pHs. None of the isolates displayed strong killer activity or were sensitive to the standard strains. All belonged to the neutral type. It was concluded that although the number of killer strains was high, this character cannot be used to protect ethanol fermentation processes against yeast contaminants like those which form cell clusters.

Avaliou-se o número de linhagens 'killer', sensíveis e neutras em leveduras isoladas de substratos relacionados à fermentação etanólica. Das 113 linhagens, 24 mostraram atividade 'Killer' contra o isolado NCYC 1006 (padrão de sensibilidade), 30 foram sensíveis ao isolado NCYC 738 (padrão 'Killer') e 59 apresentaram reação neutra para ambos os isolados. Três cepas de leveduras selvagens do processo (duas de Sacch. cerevisiae e uma de Candida colliculosa, que formam cachos de células não separáveis por tratamentos químicos ou físicos), foram testadas contra 10 isolados padrões do tipo 'Killer' e um isolado padrão de sensibilidade. Os ensaios células x células e células X toxinas foram realizados em diferentes pH e a 30ºC. As três cepas contaminantes mostraram reação neutra a todos os isolados padrões testados. Apesar do alto número de linhagens 'Killer' entre aquelas testadas, concluiu-se que este caráter não pode ser utilizado na proteção do processo de fermentação etanólica contra essas leveduras selvagens contaminantes.