Avaliação da influência dos genótipos do gene PYCARD e da inflamação no consumo de ração, peso e indução de asma em camundongos geneticamente selecionados para alta ou baixa resposta inflamatória

A asma é uma patologia heterogênea e multifatorial, caracterizada pela inflamação das vias aéreas. Uma das comorbidades que impactam essa patologia é a obesidade. Estudos mostram relação entre asma, obesidade e a ativação da via do inflamassoma, buscando compreender melhor essa associação foram utilizados, no presente trabalho, camundongos geneticamente selecionados para a resposta inflamatória aguda máxima (AIRmax) e mínima (AIRmin). A ativação do inflamassoma é essencial no processamento das citocinas IL-1β e IL-18. Essas ativações dependem da proteína adaptadora ASC, codificada pelo gene PYCARD. Foram produzidas no Laboratório de Imunogenética sublinhagens da inflamação portadoras dos diferentes genes do PYCARD. Após a genotipagem, foi observado que os animais AIRmax possuíam os alelos fixados em homozigose no gene (C/C), mas os AIRmin apresentavam polimorfismo. Através de acasalamentos assistidos por genotipagem, foram produzidas as sublinhagens AIRmin com os genótipos de PYCARD (C/C, T/T), em que os animais T/T apresentavam uma mutação , levando ao mal funcionamento da via do inflamassoma. O objetivo deste estudo foi avaliar a interferência dos alelos do gene PYCARD no ganho de peso e consumo de ração nos animais da linhagem AIR. Além de padronizar um protocolo de indução a asma. Nossos resultados mostram que a ingestão de alimentos é semelhante em AIRmax e AIRmin C/C. Em todas as linhagens, as fêmeas comem menos e são mais leves que os machos. Os animais AIRmin C/C possuem o maior peso em relação às outras linhagens, e os AIRmin T/T apresentam o menor peso. Nossa avaliação da mecânica pulmonar demonstrou que a linhagem AIRmin (C/C ou T/T) apresenta resistência das vias aéreas (Rn) e do parênquima (G) mais altas que AIRmax. Já na elasticidade das vias aéreas os animais AIRmax apresentaram valores mais altos. Após a indução à asma, os animais AIRmax e AIRmin C/C obtiveram uma maior porcentagem de eosinófilos no lavado pulmonar. Quando comparamos os animais AIRmin pudemos observar que os AIRmin C/C. apresentaram maior quantidade de eosinófilos que os AIRmin T/T, além disso, os AIRmin T/T foram a única linhagem que não demonstrou diferença da porcentagem de eosinófilos entre os grupos experimentais e controles. Quanto aos demais tipos celulares, para os macrófagos/monócitos os AIRmin T/T apresentaram os maiores valores, os AIRmax, intermediários e os AIRmin C/C, os menores. Enquanto, os animais AIRmin C/C apresentaram maiores valores de linfócitos em relação às outras duas linhagens. Ao testar os diferentes protocolos de indução à asma experimental utilizando ovalbumina, nossos resultados mostraram uma tendência diferencial, porém é necessário mais ensaios para definir o melhor protocolo. Desta forma, nossos resultados evidenciam uma correlação entre asma e inflamassoma, bem como a compreensão da função pulmonar na linhagem AIR e seu acúmulo de peso.

AIM2 inflammasome activation may mediate high mobility group box 1 release in murine allergic rhinitis / Ativação do inflamassoma AIM2 pode mediar a liberação da proteína do grupo Box-1 de alta mobilidade no modelo murino de rinite alérgica

Abstract Introduction: High mobility group box 1 protein participates in the pathogenesis of allergic rhinitis. Activation of the inflammasome can mediate the release of high mobility group box 1. The role of the absent in melanoma 2 inflammasome in allergic rhinitis remains unclear. Objective: This study aimed to investigate the function of absent in melanoma 2 inflammasome in murine allergic rhinitis and the interaction between high mobility group box 1 and the absent in melanoma 2 inflammasome. Methods: A murine allergic rhinitis model was established using twenty Balb/c mice. Expression of the components of the absent in melanoma 2 inflammasome: absent in melanoma 2, apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (Asc), caspase-1 p20, and additional nod-like receptor family pyrin domain containing 3 (Nlrp3) were detected by western blotting during allergic rhinitis. Alterations of absent in melanoma 2, caspase-1, and high mobility group box 1 after ovalbumin challenge were demonstrated by immunohistochemistry. TdT-mediated dUTP Nick end labeling, TUNEL assay, and cleavage of caspase-3 and PARP-1 were used for the observation of pyroptosis. Results: Eosinophilia and goblet cell infiltration were observed in the nasal mucosa of mice in the allergic rhinitis group. Absent in melanoma 2, Asc, and caspase-1 p20 increased after ovalbumin exposure while Nlrp3 did not. High mobility group box 1 was released in the nasal mucosa of allergic rhinitis mice. TUNEL-positive cells increased in the epithelium and laminae propria, whereas cleavage of caspase-3 and PARP-1 was not observed. Conclusions: The absent in melanoma 2 inflammasome was activated and pyroptosis may occur in the nasal mucosa after ovalbumin treatment. These may contribute to the translocation of high mobility group box 1 and the development of allergic rhinitis.

Resumo Introdução: A proteína do grupo Box-1 de alta mobilidade participa da patogênese da rinite alérgica. A ativação do inflamassoma pode mediar a liberação de proteína do grupo Box-1 de alta mobilidade. O papel do inflamassoma ausente no melanoma 2 na rinite alérgica permanece incerto. Objetivo: Investigar a função do inflamassoma ausente no melanoma 2 em um modelo murino de rinite alérgica e a interação entre a proteína do grupo Box-1 de alta mobilidade e o inflamassoma ausente no melanoma 2. Método: Um modelo murino de rinite alérgica foi estabelecido com 20 camundongos Balb/c. A expressão dos componentes do inflamassoma ausente no melanoma 2, da proteína speck-like associada à apoptose com CARD (Asc), da caspase-1 p20 e do domínio de pirina da família NLR adicional com 3 (Nlrp3) foi detectada por western blotting durante a rinite alérgica. Alterações de inflamassoma ausente no melanoma 2, na caspase-1 e na proteína do grupo Box-1 de alta mobilidade após o teste de provocação com ovalbumina foram demonstradas por imuno-histoquímica. O ensaio dUTP Nick-End Labeling mediado por TdT, TUNEL e clivagem de caspase-3 e PARP-1 foram usados para a observação de piroptose. Resultados: Eosinofilia e infiltração de células caliciformes foram observadas na mucosa nasal de camundongos do grupo rinite alérgica. Inflamassoma ausente no melanoma 2, Asc e caspase-1 p20 aumentou após a exposição à ovalbumina, enquanto Nlrp3 não aumentou. A proteína do grupo Box-1 de alta mobilidade foi liberada na mucosa nasal de camundongos com rinite alérgica. As células TUNEL-positivas aumentaram no epitélio e na lâmina própria, enquanto a clivagem da caspase-3 e a PARP-1 não foram observadas. Conclusão: O inflamassoma ausente no melanoma 2 foi ativado e pode ocorrer piroptose na mucosa nasal após o tratamento com ovalbumina. Esses fatores podem contribuir para a translocação de proteína do grupo Box-1 de alta mobilidade e o desenvolvimento de rinite alérgica.

Validação da importância funcional das Natterinas na resposta imune inata em zebrafish por CRISPR/Cas9, um método de loss-of-function

Zebrafish presents Natterin-like isoforms that share identity with the Natterina family, an important aerolysin for membrane penetration and inflammasome activation. The aim of this project is to silence the natterin-like gene in zebrafish using the CRISPR/Cas9 depletion system to assess the molecule's action in the body's immune defense against pathogens and its homeostatic function. Initially, we verified the susceptibility of zebrafish to infection with pathogens that activate the canonical and non-canonical pathways of the inflammasome. Thus, zebrafish larvaes with 1 day post fertilization (dpf) were exposed for 2 h to the bacteria Staphylococcus aureus and to Salmonella typhimurium for analysis of the effect on survival, embryonic development, locomotor activity and activation of the inflammasome immediately after the infection. The larvaes showed defects in embryonic development and behavioral change, and responded to infection by S. aureus and S. typhimurium with the production of mature caspase-a. Then, after synthesizing the sgRNA complex (trcarRNA + natterin-like crRNA, XM_017356964 / 2) for the complementary target in the second exon of the natterin-like gene on chromosome 7 (ID: 795232) the complex was microinjected into 0 embryos hpf with Cas9 enzyme in different concentrations (50 μg / nL: 250 μg / nL, 50: 125, 25: 125 and 12.5: 125) for gene depletion and obtaining KO embryos. The complete absence of natterin-like in the entire body of embryos depleted by CRISPR/Cas9 was confirmed by in situ hybridization. All concentrations delayed embryonic development with changes in the body's morphology with anomalies development and induced persistent mortality up to 144 hpf, dose-dependent. Lastly, WT larvae and depleted larvae of the natterin-like gene by CRISPR/Cas9 (sgRNA 50 ng/μL: Cas9 250 ng/μL) were exposed to infection in 1 dpf by S. aureus and S. typhimurium for 15 min, 30 min, 1 h and 2 h. Immediately after infection, the effect on survival, embryonic development, locomotor activity and activation of the inflammasome was evaluated. The absence of natterin-like in larvae (1 dpf) altered the response to infection by S. aureus and S. typhimurium inducing changes in locomotor activity in zebrafish associated with the decreased production of caspase-a and caspase-b at all times of infection performed. Our results show that natterin-like is crucial for the embryonic development of zebrafish and acts as an effector molecule in the innate immune response against bacterial pathogens activating the inflammasome complex in zebrafish.

Zebrafish apresenta isoformas de Natterin-like que compartilham identidade com a família Natterina, uma aerolisina importante para penetração em membranas e ativação do inflamassoma. O objetivo deste projeto é silenciar o gene da natterin-like em zebrafish utilizando o sistema de depleção CRISPR/Cas9 para avaliar a ação da molécula na defesa imune do organismo contra patógenos e sua função homeostática. Inicialmente verificamos a suscetibilidade do zebrafish para infecção com patógenos que ativam as vias canônica e não-canonica do inflamassoma. Assim, larvas de zebrafish com 1 dia após fertilização (dpf) foram expostas por 2 h às bactérias Staphylococcus aureus e Salmonella typhimurium para análise da sobrevivência, desenvolvimento embrionário, atividade locomotora e ativação do inflamassoma. As larvas apresentaram defeitos no desenvolvimento embrionário e no comportamento locomotor e responderam à infecção por S. aureus (canônico) e S. typhimurium (não- canônico) com a produção de caspase-a madura. Em seguida, após sintetizar o complexo sgRNA (trcarRNA + crRNA natterin-like, XM_017356964/2) para o alvo complementar no segundo exon do gene da natterin-like gene no cromossomo 7 (ID: 795232) o complexo foi microinjetado em embrioes de 0 hpf com a enzima Cas9 em diferentes concentracoes (50 μg/nL:250 μg/nL, 50:125, 25:125 e 12.5:125) para a depleção do gene e obtenção de embrioes depletados KO. A ausência completa de natterin-like no corpo inteiro dos embriões depletados por CRISPR/Cas9 foi confirmada por hibridização in situ. Todas as concentracoes atrasaram o desenvolvimento embrionario com alterações na morfologia do corpo com desenvolvimento de anomalias e induziram mortalidade persistente ate 144 hpf, dose- dependente. Por fim, larvas WT e larvas depletadas do gene natterin-like por CRISPR/Cas9 (sgRNA 50 ng/μL: Cas9 250 ng/μL) foram expostas à infecção em 1 dpf por S. aureus e S. typhimurium durante 15 min, 30 min, 1 h e 2 h. Imediatamente após a infecção foi avaliado o efeito na sobrevivência, no desenvolvimento embrionário, atividade locomotora e na ativação do inflamassoma. A ausência de natterin-like em larvas (1 dpf) alterou a resposta à infecção por S. aureus e S. typhimurium induzindo aumento na mortalidade e hiperatividade locomotora, indicativo de altos níveis de estree ou ansiedade. Confirmamos que a suscetibilidade à infecção nas larvas depletadas de natterin-like está relacionada à expressão deficiente de caspase-a e caspase-b. Podemos concluir que a natterin-like é crucial para o controle da ativação do inflamassoma responsável por garantir uma resposta inflamatória eficiente contra patógenos, visando à eliminação bacteriana e a sobrevivência do próprio hospedeiro.

The role of jaboticaba (Plinia jaboticaba (VELL. ) Berg) phenolic compounds in obesity-associated intestinal inflammation / O papel dos compostos fenólicos da jabuticaba (Plinia jaboticaba (VELL. ) Berg) na inflamação intestinal associada à obesidade

Jaboticaba (Plinia jaboticaba (Vell.) Berg) is a Brazilian native fruit belonging to the Myrtaceae family. Previously it was demonstrated that phenolicrich extracts from jaboticaba (PEJ) possess health-beneficial properties in dietinduced obesity; however, whether PEJ modulates the obesity-associated intestinal inflammatory status remains unclear. The objective of the present study was to evaluate the effect of PEJ on intestinal inflammation associated with obesity induced by a high-fat-sucrose (HFS) diet. Thus, forty male C57BL/6J mice were distributed into two groups: negative control (CH, 10 animals), fed standard diet AIN96M and water ad libitum; and positive control (HFS, 30 animals), fed HFS diet and water ad libitum induced to obesity for an initial period of 14 weeks. After this period, the HFS group was redistributed in three groups of 10 animals each, and continuously fed HFS diet for another 14 weeks: HFS group received daily gavages of water, PEJ1 group received PEJ at the dose of 50 mg of gallic acid equivalent (GAE)/kg body weight (BW and PEJ2 group received PEJ at the dose of 100 mg GAE/kg BW. Feed intake and body mass were monitored weekly, and fasting glucose biweekly. The initial period of obesity-induction demonstrated that the HFS diet was efficient to promote a significant body weight gain and fasting hyperglycemia when compared to the negative control group (CH). At the end of the experiment the animals were euthanized under anesthesia and their organs and tissues were collected. The major classes of phenolic compounds found in PEJ were ellagitannins, anthocyanins including cyanidin and delphinidin glycosides, proanthocyanidins, and free ellagic acid. PEJ-treated animals presented a reduced body weight gain, adiposity and demonstrated significant reversion of insulin resistance and dyslipidemia. In addition, the inflammatory profile of colon demonstrated that PEJ prevented metabolic endotoxemia linked to an attenuation of the HFS diet-induced intestinal inflammation via downregulation of pro-inflammatory mediators such as tumor necrosis factor (TNF-ß), membrane transporter toll-like receptor-4 (TLR-4) and nuclear factor-κB (NF-κB) in the colon. These anti-inflammatory effects appear to be involved, at least in part, with an inhibition of the colonic inflammasome pathway of obese mice. Collectively, our data reveals that PEJ exerts a direct anti-inflammatory effect in obesity-associated intestinal inflammation and this outcome is linked to an amelioration of metabolic endotoxemia in obese mice

A jabuticaba (Plinia jaboticaba (Vell.) Berg) é uma fruta nativa brasileira pertencente à família Myrtaceae. Anteriormente, foi demonstrado que extratos ricos em fenólicos de jabuticaba (PEJ) possuem propriedades benéficas à saúde na obesidade induzida por dieta; no entanto, se o PEJ modula o estado inflamatório intestinal associado à obesidade ainda não está claro. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do PEJ na inflamação intestinal associada à obesidade induzida por uma dieta rica em sacarose (HFS). Assim, quarenta camundongos C57BL / 6J machos foram distribuídos em dois grupos: controle negativo (CH, 10 animais), alimentados com dieta padrão AIN96M e água ad libitum; e controle positivo (HFS, 30 animais), alimentado com dieta HFS e água ad libitum induzida à obesidade por um período inicial de 14 semanas. Após este período, o grupo HFS foi redistribuído em três grupos de 10 animais cada, e continuamente alimentado com dieta HFS por mais 14 semanas: o grupo HFS recebeu gavagens diárias de água, o grupo PEJ1 recebeu PEJ na dose de 50 mg de ácido gálico equivalente (GAE) / kg de peso corporal (pc) e o grupo PEJ2 recebeu PEJ na dose de 100 mg GAE / kg pc. O consumo de ração e a massa corporal foram monitorados semanalmente e a glicemia de jejum quinzenal. O período inicial de indução da obesidade demonstrou que a dieta HFS foi eficiente em promover significativo ganho de peso corporal e hiperglicemia de jejum quando comparada ao grupo controle negativo (HC). Ao final do experimento os animais foram submetidos à eutanásia sob anestesia e seus órgãos e tecidos coletados. As principais classes de compostos fenólicos encontrados em PEJ foram elagitaninos, antocianinas incluindo cianidina e delfinidina glicosiladas, proantocianidinas e ácido elágico livre. Os animais tratados com PEJ apresentaram redução do ganho de peso corporal, adiposidade e reversão significativa da resistência à insulina e dislipidemia. Além disso, o perfil inflamatório do cólon demonstrou que o PEJ evitou a endotoxemia metabólica ligada a uma atenuação da inflamação intestinal induzida pela dieta de HFS por meio da regulação negativa de mediadores pró-inflamatórios, como o fator de necrose tumoral (TNF-), transportador de membrana toll- como o receptor 4 (TLR-4) e o fator nuclear B (NF-B) no cólon. Esses efeitos anti-inflamatórios parecem estar envolvidos, pelo menos em parte, com uma inibição da via do inflamassoma colônico de camundongos obesos. Coletivamente, nossos dados revelam que o PEJ exerce um efeito anti-inflamatório direto na inflamação intestinal associada à obesidade e esse resultado está relacionado com uma melhora da endotoxemia metabólica em camundongos obesos

Regulación del inflamasoma NLRP3: bioquímica y más allá de ella / Regulation of NLRP3 inflammasome: Biochemistry and beyond / Regulação do inflamassoma NLRP3: bioquímica e além dela

La inmunidad innata responde a la infección y al daño tisular activando una plataforma molecular denominada inflamasoma. En las investigaciones clínicas con humanos, se han descrito cuatro clases de inflamasomas relacionados con procesos inflamatorios: NLRP1, NLRC4, NLRP3 y AIM-2. De ellos, NLRP3 es el mejor estudiado. Los inflamasomas tienen como finalidad común el procesamiento y activación de la caspasa-1, enzima responsable de la maduración de pro-IL-1β y pro-IL-18. El control génico y la regulación bioquímica de esta plataforma son fundamentales para evitar el desarrollo de enfermedades inmunológicas, metabólicas y neurológicas. Algunos de los mecanismos más importantes en la modulación de la actividad del inflamasoma son: los polimorfismos en los genes codificadores de las proteínas del inflamasoma, la ubiquitinación, la regulación redox, la concentración de ATP y la señalización paracrina mediante factores de transcripción e interleucinas. Existe, además, otro tipo de regulación que se ejerce por mecanismos epigenéticos como la metilación y la expresión de micro-ARN. En conjunto, estos mecanismos son indispensables para la expresión coordinada y el funcionamiento correcto de estas plataformas moleculares ante un determinado patógeno o daño celular. Las investigaciones sobre los diversos componentes de los inflamasomas y su inhibición controlada están esclareciendo aspectos que permitirán controlar enfermedades asociadas con estos complejos moleculares.

Innate immunity responds to infectious agents and tissue injury with a multiproteic molecular platform named inflammasome. A large number of investigations have described four inflammasome types related to inflammatory processes in humans: NLRP1, NLRC4, NLRP3 y AIM-2. NLRP3 is a key sensor molecule in the inflammasome activity that is directed to the activation of caspase-1, the enzyme responsible for the transformation of pro-IL-1β and pro-IL-18 to their mature active forms. Genetic control and biochemical regulation of this platform are necessary for the prevention of immunologic, metabolic and neurological diseases. Polymorphisms of the genes that codify for the proteins of the inflammasome, ubiquitination, redox regulation, ATP concentration and signaling via transcription factor and interleukins are key players in the modulation of inflammasome activity. In addition, regulation is also accomplished by epigenetic mechanisms such as methylation and the expression of microRNAs. All these mechanisms are indispensable for the coordinated expression and normal functioning of these platforms in response to a pathogenic agent or cellular damage. Investigation on the various inflammasome components and their controlled inhibition are clarifying aspects that should permit to control disease conditions related to these molecular complexes.

A imunidade inata responde à infecção e ao dano teciduais ativando uma plataforma molecular denominada inflamassoma. Nas investigações clínicas com humanos, descreveram-se quatro classes de inflamassomas relacionados com processos inflamatórios: NLRP1, NLRC4, NLRP3 e AIM-2. Deles, NLRP3 é o melhor estudado. Os inflamassomas têm como finalidade comum o processamento e ativação da caspase-1, enzima responsável da maturação de pró- IL-1β e pró-IL-18. O controle genético e a regulação bioquímica desta plataforma são fundamentais para evitar o desenvolvimento de doenças imunológicas, metabólicas e neurológicas. Alguns dos mecanismos mais importantes na modulação da atividade do inflamassoma são: os polimorfismos nos genes codificadores das proteínas do inflamassoma, a ubiquitinação a regulação redox, a concentração de ATP e a sinalização parácrino mediante fatores de transcrição e interleucinas. Existe, ademais, outro tipo de regulação que se exerce por mecanismos epigenéticos como a metilação e a expressão de micro-RNA. Em conjunto, estes mecanismos são indispensáveis para a expressão coordenada e o funcionamento correto destas plataformas moleculares ante um determinado patogênico ou dano celular. As investigações sobre os diversos componentes dos inflamassomas e sua inibição controlada estão esclarecendo aspectos que permitirão controlar doenças associadas com estes complexos moleculares.