Conformational and sequential epitopes on the human granulocyte-colony stimulating factor molecule (hG-CSF) and their role in binding to human placenta receptors.

Monoclonal antibodies (mAbs) named 8C2 and 6E3, directed against the recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF), were used as probes to study the cytokine orientation on its binding to receptors from human placenta. Competition enzyme linked immunoabsorbent assays (ELISA) revealed that mAb 8C2 would be directed to a linear epitope, whereas mAb 6E3 would delimit a more assembled epitope. Gel-filtration high performance liquid chromatography (HPLC) of the immune complexes formed by incubating [(125)I]hG-CSF with each mAb showed that epitope 8C2, but not 6E3, was altered after cytokine iodination. In addition, mAb 6E3 completely inhibited [(125)I]hG-CSF binding to human placental microsomes. Although [(125)I]mAb 6E3 was unable to bind to preformed hG-CSF-receptor complexes, [(125)I]mAb 8C2 did recognize hG-CSF previously bound to receptors, suggesting that epitope 8C2 would remain accessible in the hG-CSF-receptor complex. To identify the cytokine region defined by mAbs, hG-CSF was digested with different proteolytic enzymes: Arg-C, Glu-C, trypsin and alpha chymotrypsin. Immunoreactivity of the resulting peptides was examined by Western blot and their sequences were established by Edman degradation. Results showed that mAb 6E3 would be directed to a conformation-dependent epitope located close to the hG-CSF binding domain and included into the sequence 1-122/123, whereas mAb 8C2 recognized the region 41-58, which represents a linear epitope left exposed after cytokine binding to receptors from human placenta.

Immune response against Trypanosoma cruzi antigens in Cebus apella monkeys.

The american primate Cebus apella has been used as an experimental model for the study of acute and chronic Chagas' disease. The antibody response elicited by 4 x 10(6) blood trypnomastigotes injected into four monkeys was analysed. Peak titres of IgM and IgG of anti-Trypanosoma cruzi antibodies were found at day 22, and between days 20 and 40 post-infection (p.i.), respectively. The ability of a Mr 37kDa (T37K) glycoprotein purified from T. cruzi epimastigotes to generate IgG anti-T. cruzi antibodies in monkeys, and protect them against a challenge with trypomastigotes, was also studied. Monkeys non-immunized with T37K reached peak values of parasitaemia between days 18 and 21 post-infection, whereas immunized monkeys had lower parasitaemias without important variation. Anti-T37K antibodies in immunized monkeys decreased from day 2 with the lowest titres between days 14 to 22 p.i., coincident with the peak of parasitaemia in control non-immunized monkeys. These results suggest that anti-T37K antibodies could be responsible for the low parasitaemia detected in immunized monkeys.

Isolation of a Trypanosoma cruzi antigen by affinity chromatography with a monoclonal antibody. Preliminary evaluation of its possible applications in serological tests.

By affinity chromatography with a monoclonal antibody (163B6), obtained in our laboratory, we have isolated a T. cruzi antigen which could be useful for differential diagnosis of Chagas' disease from leishmaniasis. This antigen, a 52-kD protein, reacted with all sera from Chagas' disease patients tested but not with sera from patients with leishmania, in ELISA. The 52-kD antigen is widely distributed in the Trypanosoma genus since the 163B6 monoclonal antibody reacts with T. rangeli and 8 strains and a clone of T. cruzi epimastigotes.

Empleo de epimastigotes formolados para la detección de anticuerpos anti-trypanosoma cruzi mediante técnicas inmunoenzimáticas / Use of formilinized epimastigotes for the detection of anti-Trypanosoma cruzi antibodies by immunoenzyme technics

Se describen dos técnicas, enzimoinmunoensayo (ELISA) y Dot-enzimoinmunoensayo, en las que se emplearon epimastigotes formolados como antígeno para la detección de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en sueros humanos. Se analizaron 50 sueros positivos y 28 negativos confirmados por inmunofluorescencia indirecta (IFI). El ELISA se realizó en forma cuantitativa, no presentó zona de superposición de resultados entre sueros positivos y negativos y la sensibilidad fue similar a la obtenida con IFI. Por ser un ensayo objetivo que no requiere equipo costosos podría reemplazr con ventajas a la IFI en el diagnóstico de enfermedad de Chagas. El Dot-EIE, una técnica sencilla, de bajo costo con mayor sensibilidad que la IFI podría ser utilizada, por no presentar falsos negativos y sólo un 2,5% de falsos positivos, para el monitoreo en bancos de sangre

Empleo de epimastigotes formolados para la detección de anticuerpos anti-trypanosoma cruzi mediante técnicas inmunoenzimáticas / Use of formilinized epimastigotes for the detection of anti-Trypanosoma cruzi antibodies by immunoenzyme technics

Se describen dos técnicas, enzimoinmunoensayo (ELISA) y Dot-enzimoinmunoensayo, en las que se emplearon epimastigotes formolados como antígeno para la detección de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en sueros humanos. Se analizaron 50 sueros positivos y 28 negativos confirmados por inmunofluorescencia indirecta (IFI). El ELISA se realizó en forma cuantitativa, no presentó zona de superposición de resultados entre sueros positivos y negativos y la sensibilidad fue similar a la obtenida con IFI. Por ser un ensayo objetivo que no requiere equipo costosos podría reemplazr con ventajas a la IFI en el diagnóstico de enfermedad de Chagas. El Dot-EIE, una técnica sencilla, de bajo costo con mayor sensibilidad que la IFI podría ser utilizada, por no presentar falsos negativos y sólo un 2,5% de falsos positivos, para el monitoreo en bancos de sangre (AU)

[Use of formalinized epimastigotes for the detection of anti-Trypanosoma cruzi antibodies using immunoenzyme technics]. / Empleo de epimastigotes formolados para la detección de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi mediante técnicas inmunoenzimáticas.

Formalin-fixed epimastigotes of T. cruzi were employed to develop an ELISA and a Dot-immunobinding assay (Dot-IA). The results were compared with those obtained by the indirect fluorescent antibody test (IFA). Fifty positive and twenty negative sera for Chagas disease, supplied by the reference center (Institute Mario Fatala Chaben, Buenos Aires, Argentina), were analyzed. When the quantitative indirect ELISA was performed, no overlapping between positive and negative sera was observed and the correlation with IFA was 100%. The sensibility of Dot-IA was greater than that of IFA with 2.5% of false positives. Dot-IA performed with epimastigotes is a simple and qualitative test which could be applied for screening of blood donors. On the other hand, the ELISA presented here is an objective test which does not require specialized equipment and could replace with advantage the IFA test for the serodiagnosis of Chagas' disease.

Empleo de epimastigotes formolados para la detección de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi mediante técnicas inmunoenzimáticas. / [Use of formalinized epimastigotes for the detection of anti-Trypanosoma cruzi antibodies using immunoenzyme technics]

Formalin-fixed epimastigotes of T. cruzi were employed to develop an ELISA and a Dot-immunobinding assay (Dot-IA). The results were compared with those obtained by the indirect fluorescent antibody test (IFA). Fifty positive and twenty negative sera for Chagas disease, supplied by the reference center (Institute Mario Fatala Chaben, Buenos Aires, Argentina), were analyzed. When the quantitative indirect ELISA was performed, no overlapping between positive and negative sera was observed and the correlation with IFA was 100

. The sensibility of Dot-IA was greater than that of IFA with 2.5

of false positives. Dot-IA performed with epimastigotes is a simple and qualitative test which could be applied for screening of blood donors. On the other hand, the ELISA presented here is an objective test which does not require specialized equipment and could replace with advantage the IFA test for the serodiagnosis of Chagas disease.

Humoral and cellular parameters of the immune system of Cebus apella monkeys. Cross reactivity between monkey and human immunoglobulins.

The humoral and cellular immunological parameters of the New World non-human primate Cebus apella were analysed. The study included: serum protein immunoelectrophoretic analysis; cross reactivity between monkey and human immunoglobulins by immunoprecipitation, ELISA and indirect immunofluorescence tests; immunoglobulin quantitation by radial immunodiffusion; and assays with peripheral blood lymphocytes involving tests for E and EAC rosettes and detection of surface markers (surface immunoglobulins and CD4-CD8 antigens). The results obtained showed that (a) at least three immunoglobulins with electrophoretic mobility corresponding to IgG, IgA and IgM which showed cross reactivity with the human ones were present in serum; (b) it was possible to evaluate the relative monkey immunoglobulin concentration using specific antibodies against human immunoglobulins and to obtain absolute values using adequate conversion factors; (c) lymphocytes forming E and EAC rosettes were found in peripheral blood in a similar proportion to that reported in man; (d) lymphocyte surface immunoglobulins were detected using anti-human immunoglobulin serum; (e) it was not possible to demonstrate the presence of T helper and T suppressor/cytotoxic lymphocytes using OK T4 and OK T8 monoclonal antibodies.

Isolation-characterization and preliminary immunological studies of a Trypanosoma cruzi antigenic component

De epimastigotes de T. cruzi (cepa Tulahuén 2) lisados por presión/descompresión, sometidos luego a una extracción acuosa, calentamiento a 100-C y filtración por Sephadex G100, fue posible obtener un componente antigénico de PM 37Kd (T37K), el que eluyó en el segundo pico de la filtración por el gel. Analizado por SDS-PAGE, mostró una sola banda homogénea, constituida por una glicoproteínmas capaz de unirse a concanavalina A. Cuando fue refiltrado por Sephacryl S200 se observó un solo pico de elución. La inmunización de conejos con T37K produjo anticuerposs que reaccionaron específicamente con la membrana de epimastigotes (analizados por inmunofluorescencia indirecta) y con la mayoría de las fracciones subcelulares del parásito, excepto la flagelar en reacciones de precipitación. Un elevado porcentaje de sueros provenientes de pacientes chagásicos, analizados por ELISA e inmunoprecipitación, mostraron poseer anticuerposs específicos para el antígeno T37K. Los títulos de ELISA con T37K fueron mayores que los obtenidos con la fracción subcelular utilizada como referencia (sobrenadante) de 30 000xg de lisado de epimastigotes), lo que estaría indicando una mayor sensiblilidad para la técnica realizada con el antígeno purificado. Estos resultados indican que T37K es altamente eficiente en la detección de anticuerposs anti-T. cruzi, ya sea en reacciones Ag-Ac de interacción primaria o secundaria. La utilización de este antígeno en ambos tipos de reacciones, asegura igualdad en la especificidad de los anticuerposs detectados, hecho que en la práctica diaria generalmente no ocurre, pues los antígenos usados para las diferentes reacciones serológicas no son los mismos

Isolation-characterization and preliminary immunological studies of a Trypanosoma cruzi antigenic component

De epimastigotes de T. cruzi (cepa Tulahuén 2) lisados por presión/descompresión, sometidos luego a una extracción acuosa, calentamiento a 100-C y filtración por Sephadex G100, fue posible obtener un componente antigénico de PM 37Kd (T37K), el que eluyó en el segundo pico de la filtración por el gel. Analizado por SDS-PAGE, mostró una sola banda homogénea, constituida por una glicoproteínmas capaz de unirse a concanavalina A. Cuando fue refiltrado por Sephacryl S200 se observó un solo pico de elución. La inmunización de conejos con T37K produjo anticuerposs que reaccionaron específicamente con la membrana de epimastigotes (analizados por inmunofluorescencia indirecta) y con la mayoría de las fracciones subcelulares del parásito, excepto la flagelar en reacciones de precipitación. Un elevado porcentaje de sueros provenientes de pacientes chagásicos, analizados por ELISA e inmunoprecipitación, mostraron poseer anticuerposs específicos para el antígeno T37K. Los títulos de ELISA con T37K fueron mayores que los obtenidos con la fracción subcelular utilizada como referencia (sobrenadante) de 30 000xg de lisado de epimastigotes), lo que estaría indicando una mayor sensiblilidad para la técnica realizada con el antígeno purificado. Estos resultados indican que T37K es altamente eficiente en la detección de anticuerposs anti-T. cruzi, ya sea en reacciones Ag-Ac de interacción primaria o secundaria. La utilización de este antígeno en ambos tipos de reacciones, asegura igualdad en la especificidad de los anticuerposs detectados, hecho que en la práctica diaria generalmente no ocurre, pues los antígenos usados para las diferentes reacciones serológicas no son los mismos (AU)

Estudios serologicos en pacientes con enfermedad de Chagas cronica. / Serological studies in patients with chronic Chagas' disease

Sueros de pacientes con enfermedad de Chagas cronica han sido serologicamente analizados. Todos ellos contenian anticuerpos anti-T. cruzi de tipo IgG, con titulos que oscilaban entre 1/640 y 1/2560 determinados por ELISA y hemaglutinacion pasiva, y 1/10 a 1/40 valorados por fijacion de complemento con lectura del 50% de lisis. En algunos sueros se han observado marcados fenomenos de prozona y variaciones en los titulos cuando fueron cuantificados por hemaglutinacion usando globulos rojos de carnero y humanos sensibilizados. Los resultados obtenidos hacen suponer que en el suero de los chagasicos cronicos deben existir anticuerpos coprecipitantes de tipo IgG, los que compiten con los anticuerpos precipitantes IgG por el antigeno, de alli las variaciones en los resultados. Como consecuencia, en la serologia de la enfermedad de anticuerpos IgG, ya que el comportamiento biologico de los anticuerpos precipitantes y coprecipitantes es distinto

Estudios serologicos en pacientes con enfermedad de Chagas cronica. / Serological studies in patients with chronic Chagas disease

Sueros de pacientes con enfermedad de Chagas cronica han sido serologicamente analizados. Todos ellos contenian anticuerpos anti-T. cruzi de tipo IgG, con titulos que oscilaban entre 1/640 y 1/2560 determinados por ELISA y hemaglutinacion pasiva, y 1/10 a 1/40 valorados por fijacion de complemento con lectura del 50% de lisis. En algunos sueros se han observado marcados fenomenos de prozona y variaciones en los titulos cuando fueron cuantificados por hemaglutinacion usando globulos rojos de carnero y humanos sensibilizados. Los resultados obtenidos hacen suponer que en el suero de los chagasicos cronicos deben existir anticuerpos coprecipitantes de tipo IgG, los que compiten con los anticuerpos precipitantes IgG por el antigeno, de alli las variaciones en los resultados. Como consecuencia, en la serologia de la enfermedad de anticuerpos IgG, ya que el comportamiento biologico de los anticuerpos precipitantes y coprecipitantes es distinto