Implementación de un método molecular para la identificación de Mycoplasma pneumoniae resistente a macrólidos / Implementation of a molecular method for the detection of macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae

Introducción: Mycoplasma pneumoniae es causa frecuente de infecciones respiratorias en niños y jóvenes. Los macrólidos son la primera línea de tratamiento. La rápida emergencia de resistencia a estos antimicrobianos ha motivado el desarrollo de métodos moleculares para su detección en muestras clínicas positivas a este patógeno. Objetivo: Implementar un método de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para la detección de resistencia a macrólidos a partir de muestras clínicas positivas a M. pneumoniae. Métodos: Se implementó una RT-PCR para la detección de las mutaciones A2058G y A2059G en el ARNr 23S de M. pneumoniae. Se analizaron 24 muestras clínicas positivas a M. pneumoniae, que provenían de pacientes con síntomas respiratorios. Se evaluó la sensibilidad, especificidad, repetibilidad y reproducibilidad de la RT-PCR. Resultados: La RT-PCR mostró un 100 % de especificidad para M. pneumoniae y un 92 % de sensibilidad, con un límite de detección de 2 copias/µL, que equivale a 10 copias/reacción. Además, se demostró la reproducibilidad y repetibilidad de estos resultados. Se obtuvo una correcta identificación de los genotipos salvaje y mutante, correspondientes a cada control. De las muestras clínicas positivas a M. pneumoniae, el 77,3 % (17/22) se identificó como sensible a macrólidos y el 22,7 % (5/22) como resistente. Conclusiones: La alta sensibilidad y especificidad del método de RT-PCR implementado permite que el Laboratorio Nacional de Referencia de Micoplasmas del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí cuente con un método eficaz para el diagnóstico de M. pneumoniae resistente a macrólidos.

Introduction: Mycoplasma pneumoniae is a common cause of respiratory track infections in children and young adults. Macrolides are the first-line treatment. The rapid emergence of resistance to these antimicrobials has motivated the development of molecular methods for their detection in clinical samples positive for this pathogen. Objective: To implement a real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) method for the detection of macrolide resistance in M. pneumoniae positive clinical samples. Methods: An RT-PCR was implemented to detect mutations A2058G and A2059G in 23S rRNA of M. pneumoniae. M. pneumoniae positive clinical samples from 24 patients with respiratory symptoms were analyzed. Sensitivity, specificity, repeatability and reproducibility of the RT-PCR assays were evaluated. Results: The RT-PCR assays showed 100% specificity to M. pneumoniae, and 92% sensitivity with a detection limit of 2 copies/µL, equivalent to 10 copies/reaction. Moreover, the repeatability and reproducibility of these results were demonstrated. Wild and mutant genotypes associated to each control were properly identified. Of the clinical samples positive for M. pneumoniae, 77.3% (17/22) were macrolide-sensitive and 22.7% (5/22) were macrolide-resistant. Conclusions: The high sensitivity and specificity of the RT-PCR method implemented provides the National Reference Laboratory of Mycoplasmas of the Institute of Tropical Medicine Pedro Kourí with an effective method for the diagnosis of macrolide-resistant M. pneumoniae.

Mycoplasma pneumoniae endophthalmitis in a Cuban pediatric patient.

Bacterial endophthalmitis is the most severe form of vision-threatening ocular infection. Mycoplasma pneumoniae is a primary respiratory pathogen that has been associated with several extrapulmonary manifestation, including ocular infection. In this work, we presented the microbiology diagnosis of an endophalmitis by M. pneumoniae using a novel A.R.I. WELL D-ONE® (CPM Scientifica, Italy) commercial micromethod in a Cuban pediatric patient. After positive M. pneumoniae confirmation, treatment with levofloxacin was initiated and successfully eliminated the ocular infection.

Implementación de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa para la detección de Mycoplasma genitalium / Implementation of a quantitative-polymerase chain reaction for the detection of Mycoplasma genitalium

El diagnóstico de las infecciones por Mycoplasma genitalium mediante métodos bacteriológicostradicionales resulta laborioso y poco práctico. Es por ello que los métodos moleculares basados en laamplificación del ADN se utilizan con fines diagnósticos de infecciones causadas por este microorganismo.En Cuba no existen informes de la implementación y utilización de los métodos de reacción en cadena dela polimerasa cuantitativa (qPCR) para la detección y cuantificación de este patógeno. En este trabajo seimplementó una qPCR para la detección y cuantificación de M genitalium mediante la amplificación de unfragmento del gen mgpB que codifica para la proteína adhesina celular, mediante la tecnología LightCycler® (Roche), utilizando los métodos de qPCR SYBR Green I y TaqMan. Se evaluó la especificidad y sensibilidad de dicha PCR utilizando ADN de M genitalium y de otros micoplasmas de origen humanos. Se logró la implementación de ambos métodos de qPCR con un límite de detección de 3,6 geq/μL, siendo la plataforma TaqMan la que mostró mejor eficiencia. Ambos métodos mostraron una alta especificidad para la detección de M genitalium y no se detectaron reacciones cruzadas con otros micoplasmas de origen humano. Se implementó por primera vez en Cuba una qPCR para la detección de M genitalium. El método TaqMan mostró mejor desempeño para la futura aplicación de esta metodología en muestras clínicas. El presente trabajo permitirá realizar estudios de caracterización genética y antigénica de las cepas circulantes en Cuba, útiles para conformar un inmunógeno vacunal(AU)

The diagnosis of M genitalium infections by bacteriological culture is not feasible due to slow growth and that is time-consuming. Consequently, molecular methods using DNA amplification are widely used in theinfection diagnosis procedure. There are no reports in Cuba of the implementation and use of quantitativePolymerase Chain Reaction methods for the detection and quantification of this pathogen. The aim of thisstudy was to implement a qPCR method for the detection of M genitalium by the amplification of the mgpBadhesin gene using two LightCycler® (Roche) protocols, SYBR Green I and TaqMan. The specifity andsensitivity were evaluated by using DNA of M. genitalium as well as other mycoplasms of human origin. Inboth qPCR-protocols, a limit of detection of 3.6 genome equivalents per μL template (geq/μL) was reached.The TaqMan protocol showed better efficiency than the SYBR Green assay. Both protocols showed a highspecificity for the detection of M. genitalium, without cross-reactions with other mycoplasmas of humanorigin. For the first time in Cuba, a qPCR for detection of M. genitalium was implemented. The TaqManmethod showed a better performance than the SYBR method and should be used for future applications inclinical samples. The present work will allow performing future studies of genetic and antigenic characterization of the circulating strains in Cuba, useful as vaccine immunogen(AU)

Detección de Mycoplasma genitalium mediante Reacción en Cadena dela Polimerasa en muestras urogenitales de individuos cubanossexualmente activos / Detection of Mycoplasma genitalium by Polymerase Chain Reaction in urogenital samples from sexually-active Cuban individuals

El diagnóstico de las infecciones por Mycoplasma genitalium mediante métodos bacteriológicos tradicionales resulta laborioso y poco práctico. Es por ello que los métodos moleculares basados en la amplificación del ADN se utilizan con fines diagnósticos de las infecciones causadas por este microorganismo. En Cuba se han realizado pocos estudios sobre la presencia de M genitalium en el tracto urogenital. El objetivo de la presente investigaciónfue detectar M genitalium en individuos cubanos sexualmente activos mediante la implementación de métodosde PCR simple. Se implementaron dos PCR simples para la detección de fragmentos de 427 pb del gen ARNribosomal 16S y 281 pb del gen de la adhesina celular MgPa de M genitalium, que se evaluaron en muestras de exudado endocervical provenientes de 300 mujeres con sintomatología urogenital y muestras de orina de 49 hombres asintomáticos sexualmente activos. Se logró un límite de detección de la PCR del ARNr 16S de aproximadamente 5 copias de genoma por reacción, mientras que para la PCR MgPa se logró la amplificación de solo 50 copias de genoma por reacción. El 3por ciento (10/300) de los exudados endocervicales y el 24,5 por ciento (12/49) de lasmuestras de orina de hombres asintomáticos resultaron positivas mediante ambas PCR. El mayor porcentaje demuestras positivas correspondió a las muestras de orina provenientes de hombres asintomáticos, que resultó superior a lo esperado. El presente trabajo permitirá realizar estudios futuros de caracterización genética y antigénica de las cepas de Mycoplasma genitalium circulantes en Cuba, útiles para conformar un inmunógenovacunal(AU)

The diagnosis of Mycoplasma genitalium infections by bacteriological culture is not feasible due to slow growthand that is time-consuming. Consequently, molecular tools using DNA amplification are widely used in the infectiondiagnosis. There are few reports in Cuba on infections caused by this pathogen. The aim of this study was todetect M genitalium in clinical samples from sexually active individuals, by two PCR assays. PCR-methods wereimplemented and evaluated on clinical samples for the detection of M genitalium using fragments of the 16SrRNA (427 pb) and mgpB adhesion genes (281 pb) as targets. The PCR assays were used on 300 endocervicalswabs from female patients with urogenital symptoms and on 49 first-void-urine samples from asymptomaticmales. The limit of detection of 16S PCR and MgPa PCR-assays were of 5 and 50 geq/μL, respectively. For theanalyzed clinical samples, 3 percent (10/300) of female swabs and 24,5 percent (12/49) of urine samples from asymptomaticmen were positive for M. genitalium by the two PCR assays. In contrast to the anticipated results, male urinesamples had the highest positive rate. Two PCR assays for the detection of M. genitalium were implemented andsuccessfully used on clinical samples, with the unexpected finding of a high positive rate in specimens fromasymptomatic men. The current work will allow performing future studies of genetic and antigenic characterizationof the circulating Mycoplasma genitalium-strains in Cuba, useful as vaccine immunogen(AU)