Caracterização da secreção cutânea do anfíbio Trachycephalus nigromaculatus e investigação da atividade antimicrobiana

Trachycephalus nigromaculatus is a helmeted treefrog belonging to the Hylidae family, distinguished by its cranial apparatus adapted for phragmosis, a unique defense strategy. Its skin is notable for the abundance of poison glands, playing a crucial role in resistance against predators and pathogens in its natural habitat. However, the chemical composition of the venom and the effects of exposure to cutaneous secretion in humans and animals remain poorly understood. This study aimed to characterize the cutaneous secretion, assess its toxic effects, and explore the antimicrobial activity of Trachycephalus nigromaculatus secretion. We employed chromatographic analyses, SDS-PAGE gel electrophoresis, and mass spectrometry to identify the fractions of cutaneous secretion. The cell-inflammatory-epithelial interaction was examined through intravital microscopy, while the impact on cell viability was evaluated using the MTT assay. Antimicrobial activity was tested in vitro against S. aureus, S. coli, and C. albicans. Results revealed a complex mixture in T. nigromaculatus cutaneous secretion, with proteins ranging from 8.5 to 77 kDa. Noteworthy components include hyaluronidase, peroxiredoxin-6, and the toxin anntoxin. MALDI- TOF analysis indicated an abundant presence of peptides. Low concentrations (1μg/mL) of the secretion exhibited significant cytotoxic activity (76%) against VERO cells. In intravital microscopy, the secretion (3 μg and 30 μg) displayed relevant toxic activity, causing loss of elasticity, edema, infiltration, and hemorrhagic points, preventing the experiment's continuation after 2 hours of injection. Within 24 hours, signs of necrosis and infiltration were evident, accompanied by an increase in adhered and migrated cells. These effects were observed within just 5 minutes of topical application. Inhibition of microbial growth was observed in crude secretion against S. coli, S. aureus, and C. albicans. At least half of the fractions tested by HPLC exhibited relevant activity. Antimicrobial activity was particularly effective against gram-positive bacteria (S. aureus) and gram-negative bacteria (S. coli), demonstrating notable antifungal action against C. albicans. These results are significant as they represent the first description of the antimicrobial activity of T. nigromaculatus cutaneous secretion, highlighting substantial inhibition against fungi. Furthermore, this study provides the first detailed description of the biochemical content of cutaneous secretion, revealing a unique composition of compounds inducing notable toxic effects both in vivo and in vitro. These findings, coupled with the distinctive cranial apparatus of this species, reinforce its efficacy as an efficient defense mechanism.

Trachycephalus nigromaculatus é uma perereca-de-capacete da família Hylidae, destacada pelo seu aparelho craniano adaptado para a fragmose, uma estratégia de defesa peculiar. Sua pele é notória pela abundância de glândulas de veneno, desempenhando um papel crucial na resistência contra predadores e patógenos em seu habitat natural. No entanto, a composição química do veneno e os efeitos da exposição à secreção cutânea em humanos e animais permanecem pouco compreendidos. Este estudo objetivou caracterizar a secreção cutânea, avaliar seus efeitos tóxicos e explorar a atividade antimicrobiana da secreção de Trachycephalus nigromaculatus. Empregamos análises cromatográficas, eletroforese em gel SDS- PAGE e espectrometria de massa para identificar as frações da secreção cutânea. A interação célula-inflamatória-epitelial foi examinada por microscopia intravital, enquanto o impacto na viabilidade celular foi avaliado pelo ensaio MTT. A atividade antimicrobiana foi testada in vitro contra S. aureus, S. coli e C. albicans. Os resultados revelaram uma mistura complexa na secreção cutânea de T. nigromaculatus, com proteínas variando de 8,5 a 77 kDa. Destacam-se hialuronidase, peroxirredoxina-6 e a toxina anntoxina. A análise MALDI-TOF indicou uma presença abundante de peptídeos. Concentrações baixas (1μg/mL) da secreção apresentaram notável atividade citotóxica (76%) contra células VERO. Na microscopia intravital, a secreção (3 μg e 30 μg) exibiu atividade tóxica relevante, causando perda de elasticidade, edema, infiltração e pontos hemorrágicos, impedindo a continuidade após 2h de injeção. Em 24 horas, sinais de necrose e infiltração foram evidentes, juntamente com um aumento na contagem de células aderidas e migradas. Esses efeitos foram observados após apenas 5 minutos de aplicação tópica. Observou-se inibição do crescimento microbiano na secreção bruta para S. coli, S. aureus e C. albicans. Pelo menos metade das frações testadas por HPLC exibiram atividade relevante. A atividade antimicrobiana foi especialmente eficaz contra bactérias gram-positivas (S. aureus) e gram-negativas (S. coli), além de apresentar notável ação antifúngica contra C. albicans. Esses resultados são significativos, pois representam a primeira descrição da atividade antimicrobiana da secreção cutânea de T. nigromaculatus, destacando uma inibição importante contra fungos. Além disso, este estudo oferece a primeira descrição detalhada do conteúdo bioquímico da secreção cutânea, revelando uma composição singular de compostos que induzem efeitos tóxicos notáveis tanto in vivo quanto in vitro. Essas descobertas, aliadas ao distintivo aparelho ósseo na cabeça desta espécie, reforçam sua eficácia como uma eficiente arma de defesa.

Identificação e caracterização bioquímica de inibidores de serinopeptidases isolados a partir da peçonha das anêmonas-do-mar Anthopleura cascaia e Aulactinia veratra

Phylum Cnidaria comprises more than 10,000 species and around 10% of them are represented by sea anemones. These animals are underexplored sources of molecules, possessing structurally diverse toxins that can act over a diverse range of pharmacological targets, including enzymes. Sea anemones represent almost 96% of the manually annotated toxins from the phylum, but until now only 5% of its species have been studied about their toxin content. In the present work, the venoms of the sea anemones Anthopleura cascaia and Aulactinia veratra were studied and accessed through mass spectrometry analysis for searching serine peptidase inhibitors. The arsenal of toxins from both venoms was elucidated. Additionally, venom’s fractions were screened for inhibitory activity over trypsin, using time-course fluorescence-based kinetic assays or Mass spectrometry-based analysis. Beyond that, the spatial distribution of serine peptidase inhibitors in both sea anemones’ tissues were shown through Mass Spectrometry Imaging by MALDITOF. In the analysis of toxins composition, it was seen that A. cascaia venom presents at least three types of toxins: cytolysins, phospholipases and a toxin similar to natterin. For A. veratra, the classification based on blastp hit similarity and relying on domain architecture of the toxin’s sequences (translated transcripts) was performed. The thorough examination over toxins sequences led to the identification of 59 proteins and peptides belonging to 14 known toxin’s families of sea anemones and to the acknowledge of 20 peptides presenting 18 new cysteine scaffolds. The venom of this sea anemone mainly relies on neurotoxins from ShK-like, β-defensins, SCRiP, ICK, EGF-like types and on serine peptidase inhibitors from Kazal and Kunitz types. Furthermore, serine peptidase inhibitors from both venoms were isolated and present main distribution over tentacles, mesenterial filaments and pedal disc of these sea anemones, suggesting the preferential stock of these toxins. In conclusion, the methodological approaches applied in this study were able of identifying the presence of serine peptidase inhibitors on the venom and tissue of sea anemones through chromatographic techniques followed by enzymatic assays, and MALDI-Imaging.

O filo Cnidaria é composto por mais de 10.000 espécies e cerca de 10% destas são anêmonas-do-mar. Estes animais são considerados fontes subexploradas de moléculas, possuindo um diverso arsenal de toxinas que podem agir sobre diferentes alvos farmacológicos, incluindo enzimas. Toxinas de anêmonas-do-mar representam cerca de 96% das toxinas anotadas para o filo Cnidaria, embora apenas 5% de suas espécies tenham sido estudadas quanto à composição de toxinas até o momento. Neste trabalho elucidamos por espectrometria de massas a composição da peçonha das anêmonas Anthopleura cascaia e Aulactinia veratra, buscando a identificação de inibidores de serinopeptidases. O arsenal de toxinas para ambas anêmonas foi elucidado. Ainda, descrevemos as etapas de purificação envolvidas na busca de inibidores e a seleção destes candidatos por meio da inibição da atividade da tripsina, avaliada por duas técnicas distintas։ Cinética enzimática e Espectrometria de massas. Adicionalmente, descrevemos a localização de candidatos a inibidores no tecido das anêmonas através do Imageamento por espectrometria de massas. Na análise sobre a composição de toxinas destas anêmonas, vimos que a peçonha da A. cascaia apresentou a existência três tipos de toxinas incluindo citolisinas, fosfolipases e naterinas. Para a espécie A. veratra, a classificação de toxinas baseadas no blastp hit e na arquitetura de domínios das toxinas foi realizada. Esta análise revelou a presença de 59 proteínas e peptídeos pertencentes a 14 famílias de toxinas de anêmonasdo-mar; além do reconhecimento de 20 peptídeos apresentando 18 novos scaffolds de cisteínas. A peçonha desta anêmona é principalmente composto por neurotoxinas do tipo ShK-like, β-defensinas, SCRiP, ICK, EGF-like e inibidores de serinopeptidases. Os dados obtidos mostram que ambas anêmonas são ricas fontes de inibidores de serinopeptidases, especialmente tipo Kunitz e Kazal. Tais inibidores apresentam distribuição na região dos tentáculos, mesentério e disco pedal das anêmonas, o que pode indicar o estoque preferencial destas toxinas. E conclusão, o conjunto de abordagens metodológicas empregadas neste trabalho foi capaz de atender os objetivos propostos: identificar a presença de inibidores de serinopeptidases na peçonha e tecido de anêmonas, tanto por fracionamento cromatográfico seguido de ensaio enzimático, quanto por MALDI-Imaging.

Phytotoxicity of plant extracts of Vismia japurensis cultivated in vivo and in vitro / Fitotoxicidade de extratos de plantas de Vismia japurensis cultivadas in vivo e in vitro

Plants that produce secondary metabolites with allelopathic activity or phytotoxicity can be biotechnologically important, serving as sources of allelochemicals, and thus contributing to the agroindustrial sector. Vismia japurensis (Hypericaceae) is an Amazonian species that grows in clumps called vismiais, from which most other plants are absent. Accordingly, the objective of this study was to identify possible phytotoxicity effects of hexane and methanol extracts of Vismia japurensis leaves and branches in vivo and from seedlings grown in vitro on Lactuca sativa. In addition, fresh and dry leaves were assayed by the sandwich method in order to determine their ability to release allelochemicals. The hexanic extract from in vitro seedlings reduced germination by 10%, while the methanol extract produced a 16% reduction in germination speed. Root growth of Lactuca sativa was inhibited by 64.7% when subjected to hexane leaf extract, by 39.3% under the influence of hexane branch extract, and by 96.09% for in vitro seedling hexanic extract. When analysed by thin layer chromatography and 1H nuclear magnetic resonance, extracts showed evidence of terpenes, anthraquinones and flavonoids, with greater intensity of signals in the aromatic region of in vitro seedling hexanic extract. Clearly, Vismia japurensis has a high biotechnological potential in terms of the production of substances of low polarity with capacity to interfere in plant development.

Plantas que produzem metabólitos secundários com atividade alelopática ou fitotóxica podem ser biotecnologicamente importantes, servindo como fontes de aleloquímicos e, assim, contribuindo para o setor agroindustrial. Vismia japurensis (Hypericaceae) é uma espécie amazônica que cresce em grupos, formando vismiais. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar possíveis efeitos fitotóxicos de extratos hexânicos e metanólicos de folhas e ramos de Vismia japurensis in vivo e de plântulas cultivadas in vitro sobre Lactuca sativa. Além disso, folhas frescas e secas foram analisadas pelo método sanduíche, a fim de determinar sua capacidade de liberação de aleloquímicos. O extrato hexânico de plântulas in vitro reduziu a germinação em 10% e o extrato metanólico promoveu uma redução de 16% na velocidade de germinação. O crescimento radicular de Lactuca sativa foi inibido em 64,7% quando submetido ao extrato hexânico das folhas, em 39,3% sob influência do extrato hexânico dos galhos e em 96,09% para o extrato de hexânico das plântulas in vitro. Quando analisados por cromatografia em camada delgada e ressonância magnética nuclear de 1H, os extratos mostraram evidências de terpenos, antraquinonas e flavonoides, com maior intensidade de sinais na região aromática do extrato hexânico das plântulas in vitro. Assim, Vismia japurensis possui elevado potencial biotecnológico em termos de produção de substâncias de baixa polaridade com capacidade de interferência no desenvolvimento de plantas.

Plant metabolite 5-pentadecyl resorcinol is produced by the Amazonian fungus Penicillium sclerotiorum LM 5679 / O metabólito vegetal 5-pentadecil resorcinol é produzido pelo fungo amazônico Penicillium sclerotiorum LM 5679

Since the classic studies of Alexander Flemming, Penicillium strains have been known as a rich source of antimicrobial substances. Recent studies have identified novel metabolites produced by Penicillium sclerotiorum that have antibacterial, antifouling and pharmaceutical activities. Here, we report the isolation of a P. sclerotiorum (LM 5679) from Amazonian soil and carry out a culture-based study to determine whether it can produce any novel secondary metabolite(s) that are not thus-far reported for this genus. Using a submerged culture system, secondary metabolites were recovered by solvent extract followed by thin-layer chromatography, nuclear magnetic resonance, and mass spectroscopy. One novel secondary metabolite was isolated from P. sclerotiorum (LM 5679); the phenolic compound 5-pentadecyl resorcinol widely known as an antifungal, that is produced by diverse plant species. This metabolite was not reported previously in any Penicillium species and was only found once before in fungi (that time, in a Fusarium). Here, we discuss the known activities of 5-pentadecyl resorcinol in the context of its mode-of-action as a hydrophobic (chaotropicity-mediated) stressor.

Desde os estudos clássicos de Alexander Flemming, as cepas de Penicillium são conhecidas como uma fonte rica em substâncias antimicrobianas. Estudos recentes identificaram novos metabólitos produzidos pela espécie Penicillium sclerotiorum com atividades antibacteriana, anti-incrustante e farmacêutica. Aqui, relatamos o isolamento de uma colônia de P. sclerotiorum (LM 5679) do solo amazônico e relatamos também o estudo baseado em cultura para determinar se ele pode produzir qualquer novo metabólito (s) secundário (s) que não foram relatados até agora para este gênero. Usando um sistema de cultura submerso, os metabólitos secundários foram recuperados por extrato de solvente seguido por cromatografia em camada delgada, ressonância magnética nuclear e espectroscopia de massa. Um novo metabólito secundário foi isolado de P. sclerotiorum (LM 5679); o composto fenólico 5-pentadecil resorcinol que é amplamente conhecido como um antifúngico que é produzido por diversas espécies de plantas. Este metabólito não foi relatado anteriormente em nenhuma espécie de Penicillium, e foi encontrado apenas uma vez em fungos (Fusarium). Aqui, discutimos as atividades conhecidas do 5-pentadecil resorcinol no contexto de seu modo de ação como um estressor hidrofóbico (mediado pela caotropicidade).

Phytotoxicity of plant extracts of Vismia japurensis cultivated in vivo and in vitro

Abstract Plants that produce secondary metabolites with allelopathic activity or phytotoxicity can be biotechnologically important, serving as sources of allelochemicals, and thus contributing to the agroindustrial sector. Vismia japurensis (Hypericaceae) is an Amazonian species that grows in clumps called vismiais, from which most other plants are absent. Accordingly, the objective of this study was to identify possible phytotoxicity effects of hexane and methanol extracts of Vismia japurensis leaves and branches in vivo and from seedlings grown in vitro on Lactuca sativa. In addition, fresh and dry leaves were assayed by the sandwich method in order to determine their ability to release allelochemicals. The hexanic extract from in vitro seedlings reduced germination by 10%, while the methanol extract produced a 16% reduction in germination speed. Root growth of Lactuca sativa was inhibited by 64.7% when subjected to hexane leaf extract, by 39.3% under the influence of hexane branch extract, and by 96.09% for in vitro seedling hexanic extract. When analysed by thin layer chromatography and 1H nuclear magnetic resonance, extracts showed evidence of terpenes, anthraquinones and flavonoids, with greater intensity of signals in the aromatic region of in vitro seedling hexanic extract. Clearly, Vismia japurensis has a high biotechnological potential in terms of the production of substances of low polarity with capacity to interfere in plant development.

Resumo Plantas que produzem metabólitos secundários com atividade alelopática ou fitotóxica podem ser biotecnologicamente importantes, servindo como fontes de aleloquímicos e, assim, contribuindo para o setor agroindustrial. Vismia japurensis (Hypericaceae) é uma espécie amazônica que cresce em grupos, formando vismiais. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar possíveis efeitos fitotóxicos de extratos hexânicos e metanólicos de folhas e ramos de Vismia japurensis in vivo e de plântulas cultivadas in vitro sobre Lactuca sativa. Além disso, folhas frescas e secas foram analisadas pelo método sanduíche, a fim de determinar sua capacidade de liberação de aleloquímicos. O extrato hexânico de plântulas in vitro reduziu a germinação em 10% e o extrato metanólico promoveu uma redução de 16% na velocidade de germinação. O crescimento radicular de Lactuca sativa foi inibido em 64,7% quando submetido ao extrato hexânico das folhas, em 39,3% sob influência do extrato hexânico dos galhos e em 96,09% para o extrato de hexânico das plântulas in vitro. Quando analisados por cromatografia em camada delgada e ressonância magnética nuclear de 1H, os extratos mostraram evidências de terpenos, antraquinonas e flavonoides, com maior intensidade de sinais na região aromática do extrato hexânico das plântulas in vitro. Assim, Vismia japurensis possui elevado potencial biotecnológico em termos de produção de substâncias de baixa polaridade com capacidade de interferência no desenvolvimento de plantas.

Plant metabolite 5-pentadecyl resorcinol is produced by the Amazonian fungus Penicillium sclerotiorum LM 5679

Abstract Since the classic studies of Alexander Flemming, Penicillium strains have been known as a rich source of antimicrobial substances. Recent studies have identified novel metabolites produced by Penicillium sclerotiorum that have antibacterial, antifouling and pharmaceutical activities. Here, we report the isolation of a P. sclerotiorum (LM 5679) from Amazonian soil and carry out a culture-based study to determine whether it can produce any novel secondary metabolite(s) that are not thus-far reported for this genus. Using a submerged culture system, secondary metabolites were recovered by solvent extract followed by thin-layer chromatography, nuclear magnetic resonance, and mass spectroscopy. One novel secondary metabolite was isolated from P. sclerotiorum (LM 5679); the phenolic compound 5-pentadecyl resorcinol widely known as an antifungal, that is produced by diverse plant species. This metabolite was not reported previously in any Penicillium species and was only found once before in fungi (that time, in a Fusarium). Here, we discuss the known activities of 5-pentadecyl resorcinol in the context of its mode-of-action as a hydrophobic (chaotropicity-mediated) stressor.

Resumo Desde os estudos clássicos de Alexander Flemming, as cepas de Penicillium são conhecidas como uma fonte rica em substâncias antimicrobianas. Estudos recentes identificaram novos metabólitos produzidos pela espécie Penicillium sclerotiorum com atividades antibacteriana, anti-incrustante e farmacêutica. Aqui, relatamos o isolamento de uma colônia de P. sclerotiorum (LM 5679) do solo amazônico e relatamos também o estudo baseado em cultura para determinar se ele pode produzir qualquer novo metabólito (s) secundário (s) que não foram relatados até agora para este gênero. Usando um sistema de cultura submerso, os metabólitos secundários foram recuperados por extrato de solvente seguido por cromatografia em camada delgada, ressonância magnética nuclear e espectroscopia de massa. Um novo metabólito secundário foi isolado de P. sclerotiorum (LM 5679); o composto fenólico 5-pentadecil resorcinol que é amplamente conhecido como um antifúngico que é produzido por diversas espécies de plantas. Este metabólito não foi relatado anteriormente em nenhuma espécie de Penicillium, e foi encontrado apenas uma vez em fungos (Fusarium). Aqui, discutimos as atividades conhecidas do 5-pentadecil resorcinol no contexto de seu modo de ação como um estressor hidrofóbico (mediado pela caotropicidade).

Phytotoxicity of plant extracts of Vismia japurensis cultivated in vivo and in vitro / Fitotoxicidade de extratos de plantas de Vismia japurensis cultivadas in vivo e in vitro

Plants that produce secondary metabolites with allelopathic activity or phytotoxicity can be biotechnologically important, serving as sources of allelochemicals, and thus contributing to the agroindustrial sector. Vismia japurensis (Hypericaceae) is an Amazonian species that grows in clumps called vismiais, from which most other plants are absent. Accordingly, the objective of this study was to identify possible phytotoxicity effects of hexane and methanol extracts of Vismia japurensis leaves and branches in vivo and from seedlings grown in vitro on Lactuca sativa. In addition, fresh and dry leaves were assayed by the sandwich method in order to determine their ability to release allelochemicals. The hexanic extract from in vitro seedlings reduced germination by 10%, while the methanol extract produced a 16% reduction in germination speed. Root growth of Lactuca sativa was inhibited by 64.7% when subjected to hexane leaf extract, by 39.3% under the influence of hexane branch extract, and by 96.09% for in vitro seedling hexanic extract. When analysed by thin layer chromatography and 1H nuclear magnetic resonance, extracts showed evidence of terpenes, anthraquinones and flavonoids, with greater intensity of signals in the aromatic region of in vitro seedling hexanic extract. Clearly, Vismia japurensis has a high biotechnological potential in terms of the production of substances of low polarity with capacity to interfere in plant development.

Plantas que produzem metabólitos secundários com atividade alelopática ou fitotóxica podem ser biotecnologicamente importantes, servindo como fontes de aleloquímicos e, assim, contribuindo para o setor agroindustrial. Vismia japurensis (Hypericaceae) é uma espécie amazônica que cresce em grupos, formando vismiais. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar possíveis efeitos fitotóxicos de extratos hexânicos e metanólicos de folhas e ramos de Vismia japurensis in vivo e de plântulas cultivadas in vitro sobre Lactuca sativa. Além disso, folhas frescas e secas foram analisadas pelo método sanduíche, a fim de determinar sua capacidade de liberação de aleloquímicos. O extrato hexânico de plântulas in vitro reduziu a germinação em 10% e o extrato metanólico promoveu uma redução de 16% na velocidade de germinação. O crescimento radicular de Lactuca sativa foi inibido em 64,7% quando submetido ao extrato hexânico das folhas, em 39,3% sob influência do extrato hexânico dos galhos e em 96,09% para o extrato de hexânico das plântulas in vitro. Quando analisados por cromatografia em camada delgada e ressonância magnética nuclear de 1H, os extratos mostraram evidências de terpenos, antraquinonas e flavonoides, com maior intensidade de sinais na região aromática do extrato hexânico das plântulas in vitro. Assim, Vismia japurensis possui elevado potencial biotecnológico em termos de produção de substâncias de baixa polaridade com capacidade de interferência no desenvolvimento de plantas.

Plant metabolite 5-pentadecyl resorcinol is produced by the Amazonian fungus Penicillium sclerotiorum LM 5679 / O metabólito vegetal 5-pentadecil resorcinol é produzido pelo fungo amazônico Penicillium sclerotiorum LM 5679

Since the classic studies of Alexander Flemming, Penicillium strains have been known as a rich source of antimicrobial substances. Recent studies have identified novel metabolites produced by Penicillium sclerotiorum that have antibacterial, antifouling and pharmaceutical activities. Here, we report the isolation of a P. sclerotiorum (LM 5679) from Amazonian soil and carry out a culture-based study to determine whether it can produce any novel secondary metabolite(s) that are not thus-far reported for this genus. Using a submerged culture system, secondary metabolites were recovered by solvent extract followed by thin-layer chromatography, nuclear magnetic resonance, and mass spectroscopy. One novel secondary metabolite was isolated from P. sclerotiorum (LM 5679); the phenolic compound 5-pentadecyl resorcinol widely known as an antifungal, that is produced by diverse plant species. This metabolite was not reported previously in any Penicillium species and was only found once before in fungi (that time, in a Fusarium). Here, we discuss the known activities of 5-pentadecyl resorcinol in the context of its mode-of-action as a hydrophobic (chaotropicity-mediated) stressor.

Desde os estudos clássicos de Alexander Flemming, as cepas de Penicillium são conhecidas como uma fonte rica em substâncias antimicrobianas. Estudos recentes identificaram novos metabólitos produzidos pela espécie Penicillium sclerotiorum com atividades antibacteriana, anti-incrustante e farmacêutica. Aqui, relatamos o isolamento de uma colônia de P. sclerotiorum (LM 5679) do solo amazônico e relatamos também o estudo baseado em cultura para determinar se ele pode produzir qualquer novo metabólito (s) secundário (s) que não foram relatados até agora para este gênero. Usando um sistema de cultura submerso, os metabólitos secundários foram recuperados por extrato de solvente seguido por cromatografia em camada delgada, ressonância magnética nuclear e espectroscopia de massa. Um novo metabólito secundário foi isolado de P. sclerotiorum (LM 5679); o composto fenólico 5-pentadecil resorcinol que é amplamente conhecido como um antifúngico que é produzido por diversas espécies de plantas. Este metabólito não foi relatado anteriormente em nenhuma espécie de Penicillium, e foi encontrado apenas uma vez em fungos (Fusarium). Aqui, discutimos as atividades conhecidas do 5-pentadecil resorcinol no contexto de seu modo de ação como um estressor hidrofóbico (mediado pela caotropicidade).

Contributing to the advancement of the state-of-the-art in biodiversity research: the role of FAPESP in the last 60 years / Contribuindo para o avanço do estado da arte da pesquisa em biodiversidade: o papel da FAPESP nos últimos 60 anos

Abstract Since its creation in 1960, the São Paulo State Research Foundation (FAPESP) has been supporting biodiversity research; however, in the early years, this large umbrella was still divided into botany, ecology, and zoology. This support became more effective by the establishment of the Research Program on Characterization, Conservation, and Sustainable Use of the Biodiversity of São Paulo State, better known as the BIOTA/FAPESP Program, in 1999. The program adopted the definition of biodiversity of the Convention on Biological Diversity and focused on 4 priorities: a) advancing scientific knowledge about Brazilian biodiversity; b) training high-level personnel (master's degrees, PhDs and postdocs) to carry out biodiversity research; c) transferring the advancement of knowledge to improve public policies on biodiversity conservation and restoration; and d) transferring private sector knowledge to economically explore the potential of Brazilian biodiversity by using it sustainably. This paper summarizes the major achievements of the BIOTA/FAPESP Program, now entering its third decade of existence.

Resumo: Desde sua criação em 1960, a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) vem apoiando a pesquisa em biodiversidade, embora nos primeiros anos este grande guarda-chuva tenha sido dividido em botânica, ecologia e zoologia. Este apoio tornou-se mais efetivo com a criação em 1999 do Programa de Pesquisa em Caracterização, Conservação e Uso Sustentável da Biodiversidade do Estado de São Paulo, mais conhecido como Programa BIOTA/FAPESP. O Programa adotou a definição de biodiversidade da Convenção sobre Diversidade Biológica, e focalizou em 4 prioridades: a) o avanço do conhecimento científico sobre a biodiversidade brasileira, b) o treinamento pessoal de alto nível (mestrado, doutorado e pós-doutorado) para a realização de pesquisas em biodiversidade, c) a transferência do avanço do conhecimento para melhorar as políticas públicas de conservação e restauração da biodiversidade, d) a transferência para o setor privado do conhecimento para explorar economicamente o potencial da biodiversidade brasileira, utilizando-o de forma sustentável. Este documento resume as principais realizações do Programa BIOTA/FAPESP, atualmente denominado Programa de Pesquisa em Caracterização, Conservação, Restauração e Uso Sustentável da Biodiversidade, agora entrando em sua terceira década de existência.

Microorganisms: the secret agents of the biosphere, and their key roles in biotechnology / Micro-organismos: os agentes secretos da biosfera, e seus papéis determinantes na biotecnologia

Abstract We present a survey of projects that have been funded by FAPESP under the BIOTA-Microorganisms program. These projects generated a wide variety of results, including the identification of novel antibacterial-producing microorganisms, the characterization of novel microbial enzymes for industrial applications, taxonomic classification of novel microorganisms in several environments, investigation of the soil and mangrove microbial ecosystems and its influence on endangered plant species, and the sequencing of novel metagenome-assembled genomes. The results surveyed demonstrate the importance of microorganisms in environments that play important roles in human activities as well as the potential that many of these microorganisms have in contributing to biotechnological applications crucial for human survival in the 21st century.

Resumo Apresentamos um levantamento comentado de projetos financiados pelo programa BIOTA-Micro-organismos. Estes projetos geraram uma variada gama de resultados, incluindo a identificação de novos micro-organismos produtores de compostos antibacterianos, a caracterização de novas enzimas microbianas para usos industriais, classificação taxonômica de novos micro-organismos presentes em diversos ambientes, investigação de ecossistemas microbianos em solos e mangues e sua influência sobre plantas ameaçadas, e o sequenciamento de vários novos genomas microbianos derivados de metagenomas. Os resultados descritos demonstram o papel-chave de micro-organismos em ecossistemas importantes para atividades humanas, assim como o potencial que vários desses micro-organismos tem de contribuir para aplicações biotecnológicas cruciais para a sobrevivência humana no século 21.

In vitro screening for growth inhibition activity on cancer cell lines of northern Chile highlands shrubs / Triagem in vitro da atividade de inibição do crescimento em linhagens celulares de câncer em arbustos das montanhas do norte do Chile

ABSTRACT: Cancer is still one of the leading causes of death worldwide. Many chemotherapeutics from plants have been tested in cancer, such as vinblastine and paclitaxel. The north of Chile, Arica & Parinacota region, is characterized by its vegetal biodiversity due to its unique geographical and climatological conditions, offering an unexplored and unique source of naturally-derived compounds. The present research has considered a screening of 26 highland herbs using an in vitro growth inhibition model in a panel of six cancer cell lines from different tissues. 5 of the 26 studied ethanolic extracts shows strong activity at least in one cell line when tested at 10 µg mL-1. We present a group of plants worthy to be evaluated as promissory extracts. This work is part of the systematic attempt to find new candidates to be used in cancer therapies.

RESUMO: O câncer ainda é uma das principais causas de morte no mundo. Muitos quimioterápicos de plantas foram testados em câncer, como vinblastina e paclitaxel. O norte do Chile, região de Arica e Parinacota, caracteriza-se por sua biodiversidade vegetal devido às suas condições geográficas e climatológicas únicas, oferecendo uma fonte inexplorada e única de compostos de origem natural. A presente pesquisa considerou uma triagem de 26 ervas das terras altas usando um modelo de inibição de crescimento in vitro em um painel de seis linhas celulares de câncer de diferentes tecidos. Cinco, dos 26 extratos etanólicos estudados, mostram forte atividade pelo menos em uma linhagem celular quando testados a 10 µg mL-1. Apresentamos um grupo de plantas dignas de serem avaliadas como extratos promissórios. Este trabalho faz parte da tentativa sistemática de encontrar novos candidatos para serem usados ​​em terapias contra o câncer.

Bioética en los procesos de investigación y bioprospección: relaciones con pueblos indígenas y comunidades locales en Colombia

Propósito/Contexto. En este artículo se exploran los principios bioéticos de autonomía y justicia, a la luz de tres casos de uso de la biodiversidad, tanto para fines investigativos como de aprovechamiento comercial, que involucran territorios colectivos de comunidades indígenas, afrodescendientes y predios de población campesina. Metodología/Enfoque. En cada caso se examinaron sus características, los actores, las relaciones entre los actores y los beneficios contemplados para las partes. El estudio comprendió la recopilación y análisis de documentación y la realización de 10 entrevistas semiestructuradas con investigadores, representantes de instituciones, empresas y organizaciones indígenas y afrocolombianas. La investigación se realizó entre 2015 y 2017 e incluyó comunidades del Amazonas, Risaralda, Chocó y Antioquia. Resultados/Hallazgos. Se encontró que las instituciones de investigación y los investigadores tramitan y obtienen las autorizaciones reglamentarias, mientras que las entidades del Estado registran una progresiva omisión de responsabilidades que afecta los derechos de las comunidades, por ejemplo, a través de la inobservancia del derecho a la consulta previa. Adicionalmente, en los casos de estudio, las relaciones que los actores establecen con las comunidades INAPRR-CL (sigla de indígenas, negros, afrodescendientes, palenqueros, raizales, Rrom, campesinas y locales) varían en la observancia de principios bioéticos. Discusión/Conclusiones/Contribuciones. Debido a que el régimen jurídico tiene un alcance limitado para el uso de la biodiversidad en investigación o innovación tecnológica, se evalúa y se discute si la bioética podría servir de guía para el respeto de la autonomía y la participación de beneficios de las comunidades en proyectos de investigación y bioprospección.

Purpose/Context. This article explores the bioethical principles of autonomy and justice in the light of three cases of use of biodiversity, both for research purposes and for commercial use, involving collective territories of indigenous communities, afro-descendants, and proper-ties of the peasant population. Methods/Approach. In each case, we examined the characteristics, agents, relationships be-tween agents, and benefits contemplated for the parties. The study included document compilation and analysis and ten semi-structured interviews with researchers, representatives of indigenous and Afro-Colombian institutions, companies, and organizations. The research was carried out between 2015 and 2017 and involved Amazon, Risaralda, Chocó, and Antioquia communities. Results/Findings. Research institutions and researchers process and obtain regulatory authorizations, while State entities report a progressive omission of responsibilities that adversely affects communities' rights, for example, through non-observance of the right to prior con-sultation. Besides, in the study cases, the agents' relationships with the INAPRRCL (acronym in Spanish for indigenous, black people, Afro-descendants, palenqueros, raizales, Rrom, peasants, and locals) vary regarding the application of bioethical principles. Discussion/Conclusions/Contributions. Because the legal system has a limited scope on the use of biodiversity in research or technological innovation, we assessed and discussed whether bioethics could serve as a guide for respecting communities' autonomy and benefit share in research and bioprospecting projects.

Objetivo/Contexto. Neste artigo exploram-se os princípios bioéticos de autonomia e justiça, à luz de três casos de uso da biodiversidade, tanto para fins investigativos como de aproveitamento comercial, que envolvem territórios coletivos de comunidades indígenas, afrodescendentes e prédios de população camponesa. Metodologia/Abordagem. Em cada caso, foram examinadas as suas características, os intervenientes, as relações entre os intervenientes e os benefícios previstos para as partes. O estudo incluiu a coleta e análise de documentação e a realização de 10 entrevistas semiestruturadas com pesquisadores, representantes de instituições, empresas e organizações indígenas e afro-colombianas. A pesquisa foi realizada entre 2015 e 2017 e incluiu comunidades do Amazonas, Risaralda, Chocó e Antioquia. Resultados/Descobertas. Verificou-se que as instituições de investigação e os investigadores processam e obtêm as autorizações regulamentares, no entanto que as entidades do Estado registram uma progressiva omissão de responsabilidades que afeta os direitos das comunidades, por exemplo, através da inobservância do direito à consulta prévia. Adicionalmente, nos casos de estudo, as relações que os atores estabelecem com as INAPRRCL (sigla de indígenas, negros, afrodescendentes, palenqueros, raizais, Rrom, camponesas e locais) variam na observância de princípios bioéticos. Discussão/Conclusões/Contribuições. Dado que o regime jurídico tem um âmbito limitado para a utilização da biodiversidade na investigação ou inovação tecnológica, se avalia e se discute se a bioética poderia servir de guia para o respeito da autonomia e a participação de benefícios das comunidades em projetos de pesquisa e bioprospeção.

Estudo da ação de inibidores peptídicos de enzimas trombina-símiles na coagulação sanguínea humana / Study of the action of thrombin-like enzymes peptides inhibitors in human blood coagulation

Ophidism is considered the most important cause of accidents by venomous animals around the world. Botropic venom is a highly complex mixture of proteins, peptides and enzymes that, when interacting with human proteins, triggers several local symptoms, such as edema, ecchymosis, pain, blisters and, in more severe cases, necrosis and limb amputation. It also causes systemic symptoms, such as blood incoagulability. The metalloproteases (SVMPs) and the serine proteases (SVSPs) are the major components of Bothrops jararaca venom and are correlated with local and systemic effects. The treatment for poisoning indicated by the Ministry of Health is the administration of botropic antivenom, which despite being highly effective, has certain limitations, such as the partial neutralization of SVSPs. Among the strategies that aim to improve the antivenom and, thus, the treatment of envenomation, is the search for selective inhibitors for SVSPs, which can act simultaneously to the antivenom. Considering the similarity of the catalytic triad between human serine proteases and SVSPs, and since inertia against human serine proteases is a prerequisite for the association of any molecule with antivenom, the present project aimed at the “Study of the action of thrombin-like enzymes peptide inhibitors in human blood coagulation”. The peptide inhibitors, selective for the inhibition of SVSPs, were designed based on a substrate hydrolyzed by these enzymes from Bothrops jararaca venom and showed different inhibition efficacy. In silico analyzes suggest that the inhibitors bound in regions distant from the catalytic triad (His, Asp and Ser) of batroxobin, a thrombin-like enzyme used as a model in studies of enzyme/peptide inhibitor interaction.

O ofidismo é considerado a causa mais importante de acidentes por animais peçonhentos em todo o mundo. O veneno botrópico é uma mistura altamente complexa de proteínas, peptídeos e enzimas que, quando interagem com as proteínas humanas, desencadeiam vários sintomas locais, como edema, equimose, dor, bolhas e, em casos mais graves, necrose e amputação do membro; e sistêmicos, como a incoagulabilidade sanguínea. As metaloproteinases (SVMPs) e as serinoproteinases (SVSPs) são os componentes majoritários do veneno de Bothrops jararaca e estão correlacionadas com os efeitos locais e sistêmicos. O tratamento para o envenenamento indicado pelo Ministério da Saúde é a administração do antiveneno botrópico, que apesar de ser altamente eficaz, apresenta certas limitações, como a parcial neutralização das SVSPs. Dentre as estratégias que visam à melhoria do antiveneno e, assim, o tratamento, está a pesquisa por inibidores seletivos de SVSPs, que possam atuar de forma sinérgica ao antiveneno. Considerando a similaridade da tríade catalítica entre serinoproteinases humanas e as SVSPs, e visto que a inércia contra serinoproteinases humanas é um pré-requisito para a associação de qualquer molécula ao antiveneno, o presente projeto objetivou o “Estudo da ação de inibidores peptídicos de enzimas trombina-símiles na coagulação sanguínea humana”. Os inibidores peptídicos, seletivos quanto à inibição de SVSPs, foram desenhados com base em substrato hidrolisado por estas enzimas do veneno de Bothrops jararaca, e apresentaram diferentes eficácias de inibição. Análises in silico sugerem que os inibidores se ligaram em regiões distantes da tríade catalítica (His, Asp e Ser) da batroxobina, uma enzima trombina-símile usada como modelo em estudos de interação da enzima/inibidor peptídico.

In vitro anthelmintic activity of Lippia gracilis Schauer essential oil against egg-hatching of goat gastrointestinal nematodes / Atividade anti-helmíntica in vitro do óleo essencial de Lippia gracilis Schauer contra a eclosão de nematódeos gastrintestinais de caprinos

Since drug-resistant nematodes became a common problem in sheep and goat industries, alternative methods using natural products have emerged as a viable and sustainable anthelmintic treatment option. Here, the in vitro effect of essential oil extracted from Lippia gracilis Schauer was assessed on the hatching process of nematodes recovered from naturally infected goats. Essential oil at concentrations of 0.08% (0.008 µL/mL), 0.12% (0.012 µL/mL), and 0.16% (0.016 µL/mL) was able to induce an average inhibition of 74.7, 84 and 93%, respectively. The effective concentration required to inhibit egg hatching in 50% of eggs (EC50) was 0.03452%. Therefore, essential oil of L. gracilis showed promisor in vitro anthelmintic results against egg-hatching of goat gastrointestinal nematodes.(AU)

Como os nematoides resistentes a drogas se tornaram um problema comum nas indústrias de ovinos e caprinos, métodos alternativos que utilizam produtos naturais surgiram como uma opção de tratamento anti-helmíntico viável e sustentável. Aqui, o efeito in vitro do óleo essencial extraído de Lippia gracilis Schauer foi avaliado no processo de eclosão de nematoides recuperados de caprinos naturalmente infectadas. O óleo essencial nas concentrações de 0,08% (0,008 µL/mL), 0,12% (0,012 µL/mL), e 0,16% (0,016 µL/mL)foi capaz de induzir uma inibição média de 74,7, 84 e 93%, respectivamente. A concentração efetiva necessária para inibir a eclosão de ovos em 50% dos ovos (CE50) foi de 0,03452%. Portanto, o óleo essencial de L. gracilis apresentou resultados anti-helmínticos in vitro promissores contra a eclosão de nematódeos gastrintestinais de caprinos.(AU)

Evaluation of antimutagenic and cytotoxic activity of skin secretion extract of Rhinella marina and Rhaebo guttatus (Anura, Bufonidae) / Avaliação da atividade antimutagênica e citotóxica da secreção cutânea de Rhinella marina e Rhaebo guttatus (Anura, Bufonidae)

The skin secretion from toads of the Bufonidae family has great potential in the search for new active compounds to be used as drug candidates in treating some diseases, among them cancer. In this context, this study aimed to evaluate the cytotoxic and antimutagenic activity of the parotoid gland secretion extracts of Rhinella marina and Rhaebo guttatus, as well as biochemically analyze transaminases and serum creatinine for liver and renal damage, respectively. Cytotoxicity was performed by the colorimetric method based on MTT (3- [4, 5-dimethyl-2-thiazolyl]-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) with different concentrations of the extracts in Walker or splenic tumor cell cultures from rats and mice. The micronucleus test was performed with male Swiss mice treated orally with the extracts for 15 days, and then intraperitoneally with N-ethyl-N-nitrosurea (50 mg kg-1). Micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) were evaluated in bone marrow. The extracts showed cytotoxic activity in the evaluated cells. There was a significant reduction in the frequency of MNPCE (R. marina = 56% and R. guttatus = 75%, p < 0.001), indicating antimutagenic potential of the extracts. The groups treated only with extract showed an increase in MNPCE frequency, evidencing mutagenic potential. Biochemical analyzes showed no significant difference between treatments. Thus, under our experimental conditions, the extracts of R. marina and R. guttatus skin secretions presented chemopreventive potential for cancer. (AU)

A secreção cutânea de anuros da família Bufonidae tem grande potencial na busca de novos compostos ativos para utilização como fármacos candidatos no tratamento de algumas doenças, entre elas o câncer. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar a atividade citotóxica e antimutagênica dos extratos da secreção da glândula parótida de Rhinella marina e Rhaebo guttatus, bem como a análise bioquímica de transaminases e creatinina séricas, para avaliar dano hepático e renal, respectivamente. A avaliação de citotoxicidade foi realizada pelo método colorimétrico baseado no MTT (3-[4, 5-dimethyl-2-thiazolyl]-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide), com diferentes concentrações dos extratos em culturas de células do Tumor de Walker ou células esplênicas de rato e camundongo. O teste do micronúcleo foi realizado com camundongos Swiss machos que receberam tratamento oral com os extratos durante 15 dias, seguido de tratamento intraperitoneal com N-etil-N-nitrosuréia (50 mg kg-1). A frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados (PCEMN) foi determinada em medula óssea. Os extratos apresentaram ação citotóxica nas células avaliadas. Houve uma redução significativa na frequência de PCEMN (R. marina = 56% e R. guttatus = 75%, p < 0,001), observando-se um potencial antimutagênico dos extratos. Os grupos tratados somente com os extratos apresentaram um aumento na frequência de PCEMNs, evidenciando um potencial mutagênico. As análises bioquímicas não apresentaram diferença significativa entre os tratamentos. Assim, nas condições experimentais testadas, as secreções cutâneas de R. marina e R. guttatus apresentaram potencial quimiopreventivo para câncer.(AU)

Caracterização bioquímica e farmacológica de compostos analgésicos presentes na secreção das glândulas parotóides dos sapos Rhinella Icterica e Rhinella marina / Biochemical and pharmacological characterization of analgesic compounds from the toads Rhinella icterica and Rhinella marina parotoids glands secretion

Currently, natural products are considered an important source of molecules with therapeutic potential. Literature demonstrates that the secretion components of frogs belonging to the Bufonidae family induce antinociceptive effect. Thus, the objectives of this study are to identify and characterize antinociceptive molecules in the secretion of parotid glands of Rhinella icterica and Rhinella marina frogs and to determine their action movements. After an initial screening, we detected the presence of four compounds with analog activity. These compounds were purified by RP-HPLC and reproduced by mass spectrometry such as Dehydrobufotenin, Bufalin, Morinobufagin and Telecinobufagin. The antinociceptive effect of these compounds was applied by the electronic Frey test using the carrageenan induced hyperalgesia model. The results showed that Bufotenin, Telecinobufagin, Marinobufagin and Bufalin at doses of 50 μg, 100 μg and 200 μg after oral administration were able to reverse carrageenan-induced hyperalgesia 30 minutes after treatment, with a peak of professional activity within 1 hour. (p < 0.001). Additionally, no motor alterations were observed for any of the four compounds, which were applied through open field test, elevated cross maze or cytotoxic activity in cardiomyocytes. The mechanisms of action involved in the analytical effect of these compounds are still available. Our results demonstrated treatment with selected antagonist for receptor 5 -HT1a (300 nmol/paw), 5-HT2a (300 nmol/paw), delta opioid (90 μg/paw) and various kappa opioid (75 μg/paw) involved in the treatment. bufotenine alkaloid-induced antinociceptive effect (200 μg/100 μL). Animals composed of steroid compounds telecinobufagin (200 μg/100μL) and marinobufagin (200 μg/100μL) suffered reversible hyperalgesia when injected with selective antagonists AM251 (40 μg/paw) and AM630 (25 μg/paw) revealing or executing receptors. CB1 and CB2, respectively, without antinociceptive effect (p < 0.001). One bufalin (200 μg/100μL) was the only steroid compound that did not involve any tested mechanism, being opioids, cannabinoids and serotoninergics. Therefore, we performed an analysis in molecules databases, considering a bufalin structure in search of action targets. The results obtained from this analysis show that bufalin is activated by chloride channels in vitro. Based on this, the evaluations or involvement of calcium-activated chloride channels and type 2 channels without antinociceptive effect due to their presence in peripheral nociceptive fibers. The results revealed or the involvement of calcium-activated chloride channels (300 μM/paw) without buffalo effect. With these data, we can confirm the antinocieptive activity of the four compounds of the paranoid secretion of the toads R. icterica and R. marina - Bufotenine, Bufalin, Marinobufagin and Telecinobufagin.

Atualmente, os produtos naturais são considerados uma importante fonte de moléculas com potencial terapêutico. A Literatura demonstra que os componentes da secreção de sapos pertencentes à família Bufonidae induzem efeito antinociceptivo. Assim, os objetivos deste estudo são identificar e caracterizar moléculas antinociceptivas na secreção das glândulas parotoides de sapos Rhinella icterica e Rhinella marina e determinar seus mecanismos de ação. Após um screening inicial detectamos a presença de quatro compostos com atividade analgésica. Estes compostos foram purificados por RP-HPLC e identificados por espectrometria de massa como Dehidrobufotenina, Bufalina, Morinobufagina e Telecinobufagina. O efeito antinociceptivo destes compostos foram avaliados pelo teste de von Frey eletrônico, utilizando o modelo de hiperalgesia induzida por carragenina. Os resultados demonstraram que a Bufotenina, Telecinobufagina, Marinobufagina e Bufalina nas doses de 50 μg, 100 μg e 200 μg após administração por via oral, conseguiram reverter a hiperalgesia induzida pela carragenina 30 minutos após o tratamento, com um pico de atividade observado em 1 hora (p<0,001). Adicionalmente, não foram observadas alterações motoras para nenhum dos quatro compostos, que foram avaliados através do teste de campo aberto, labirinto em cruz elevado ou atividade citotóxica em cardiomiócitos. Avaliamos ainda os mecanismos de ação envolvidos no efeito analgésico destes compostos. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o antagonista seletivo para receptores 5- HT1a (300 nmol/pata), 5-HT2a (300 nmol/pata), delta opióide (90 μg/pata) e kappa opióide (75 μg/pata) estão envolvidos no efeito antinociceptivo induzido pelo alcaloide bufotenina (200 μg/100 μL). Já os animais tratados com os compostos esteroides telecinobufagina (200μg/100μL) e marinobufagina (200μg/100μL) tiveram a hiperalgesia revertida quando foram injetados com os antagonistas seletivos AM251 (40 μg/pata) e AM630 (25 μg/pata) revelando o envolvimento de receptores CB1 e CB2 respectivamente no efeito antinociceptivo (p<0,001). A bufalina (200μg/100μL) foi o único composto esteroide que não apresentou envolvimento de nenhum dos mecanismos testados, sendo eles opióides, canabinóides e serotoninérgicos. Portanto, realizamos análise em bancos de dados de moléculas considerando a estrutura da bufalina na busca por alvos de ação. Os resultados obtidos a partir dessa análise mostraram que a bufalina é ativadora de canais de cloreto in vitro. Com base nisso, avaliamos o envolvimento dos canais de cloreto ativados por cálcio e dos canais tipo 2 no efeito antinociceptivo, devido sua presença em fibras nociceptivas periféricas. Os resultados revelaram o envolvimento de canais de cloreto ativados por cálcio (300 μM/pata) no efeito da bufalina. Com esses dados, podemos confirmar a atividade antinocieptiva dos quatro compostos isolados da secreção das parotóides dos sapos R. icterica e R. marina - Bufotenina, Bufalina, Marinobufagina e Telecinobufagina.

Estabelecimento de metodologia de diferenciação de células tronco embrionárias de camundongo em células precursoras de oligodendrócitos: uma plataforma para triagem de novas drogas remielinizantes / Establishment of a mouse embryonic stem cell line differentiation methodology into oligodendrocyte precursor cells: a platform for remyelinating drug screening.

The myelin sheath plays a crucial role in nerve function. In the Central Nervous System, the myelin sheath is produced by oligodendrocytes (OL), which are differentiated from oligodendrocyte precursor cells (OPC). Several neurological disorders, including multiple sclerosis, display damage in the myelin sheath and failure in the remyelination. Therefore, researching for new compounds that act in the OPCs differentiation to OLs is a promising strategy to treat demyelinating diseases. In this study, we established a methodology that allows the generation of OPCs in large quantities from two lineages of mouse embryonic stem cells (mESCs; lineages HM-1 and USP-1). Initially, mESCs were induced to differentiate into neural precursors and, later, to OPCs by adding growth factors such as FGF, EGF and PDGF. The characteristic and predominant expression of Olig2, Sox-10, PDGFRα and NG2 observed by immunofluorescence, and the double labeling of PDGFRα and NG2 by flow cytometry, confirmed the OPCs generation from mESCs. Therefore, this study shows an efficient and reproducible methodology for generating OPCs capable of being used in screening assays or in OLs lineage biology studies.

A bainha de mielina desempenha um papel crucial nas funções nervosas. No sistema nervoso central, a bainha de mielina é produzida por oligodendrócitos (OLs), os quais são diferenciados a partir de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Em várias desordens neurológicas, entre elas, a Esclerose Múltipla, a bainha de mielina é danificada e a remielinização deixa de acontecer. Desse modo, a busca por novos compostos que atuem na diferenciação de OPCs a OLs, é um caminho promissor na terapia de doenças desmielinizantes. Neste estudo, estabelecemos uma metodologia que permitiu gerar OPCs a partir de duas linhagens de células tronco embrionárias de camundongos (mESCs – linhagens USP-1 e HM-1). Inicialmente, as mESCs foram induzidas a diferenciar em precursores neurais e, posteriormente, a OPCs, pela adição de fatores de crescimento como FGFb, EGF e PDGF-AA. A expressão característica e predominante de Olig2, Sox10, PDGFRα e NG2 observada por imunofluorescência e a dupla marcação de PDGFRα e NG2 por citometria de fluxo (com rendimentos de 88,3-87,3%) confirmaram a obtenção de OPCs a partir de mESCs. Estas células podem ser expandidas por 5 passagens adicionais e ainda serem capazes de gerar bilhões de OPC puros. Portanto, o estudo apresenta uma metodologia eficiente e reprodutível que permite a geração de um modelo a ser empregado em triagem de novas drogas ou no estudo da biologia da linhagem de OLs.