Evaluación de la elución de sensidiscos para la determinación de susceptibilidad a colistín en bacilos gramnegativos multi-resistentes / Evaluation of sensi-disk elution for colistin susceptibility determination in multidrug resistant gramnegative bacilli

Resumen Utilizando cepas clínicas de bacilos gramnegativos multi-resistentes (MDR), comparamos las CIM obtenidas de la microdilución en caldo, el método de referencia y el método de elución de sensidiscos. Encontramos que, con la excepción de A. baumannii, los resultados fueron muy similares. El método de elución de sensidiscos podría ser una buena alternativa y confiable para la determinación de la resistencia a colistín.

Abstract Using clinical strains of multidrug resistant (MDR) Gram negative bacilli, we compared MICs obtained from both broth microdilution, the reference method, and sensi-disk elution method. We found that, with A. baumannii exception, results were very similar. Sensi-disk elution method could be a good and reliable alternative for colistin resistance determination.

Comparación y evaluación de métodos cuantitativos para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de cepas del complejo Mycobacterium abscessus / Comparison and Evaluation of Quantitative Methods for Determining Antimicrobial Susceptibility of Complex Mycobacterium Abscessus Strains / Comparação e avaliação de métodos quantitativos para determinar a susceptibilidade antimicrobiana de cepas do complexo Mycobacterium abscessos

Resumen Introducción: el complejo Mycobacterium abscessus incluye especies patógenas emergentes multirresistentes, lo cual limita las opciones terapéuticas para tratar las infecciones causadas por dichos microorganismos. En este estudio se compararon las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) obtenidas mediante dos métodos cuantitativos, se establecieron los puntos de corte empleados en el micrométodo colorimétrico (MMC) y se evaluó la susceptibilidad antimicrobiana. Materiales y métodos: la CIM de nueve antibióticos fue determinada mediante el MMC y la microdilución en caldo (MDC) para 19 cepas del complejo M. abscessus. El test F de Snedecor se utilizó para establecer la diferencia significativa de las CIM entre los dos métodos y se determinaron los puntos de corte mediante la técnica de distribución de la probabilidad para el MMC. Resultados: se encontró una correlación de los resultados de la CIM del 50% entre MMC y MDC para los antibióticos ensayados. Probablemente esta discrepancia en los resultados se deba a diferencias en algunos parámetros técnicos de cada procedimiento. Todas las cepas fueron sensibles a la amikacina y resistentes a meropenem y ampicilina-sulbactam. Independientemente de la especie del complejo M. abscessus, las fluoroquinolonas mostraron una baja actividad inhibitoria (0-25%) sobre los aislados clínicos, resultados que son similares a los reportados por otros autores. Conclusión: Los patrones de multirresistencia observados en las cepas analizadas sugieren la necesidad de utilizar las pruebas de susceptibilidad como herramientas que permitan orientar y optimizar las conductas terapéuticas en infecciones producidas por M. abscessus.

Abstract Introduction: The Mycobacterium abscessus complex includes multidrug resistant emerging pathogens, which limit therapeutic options for treating infections caused by these microorganisms. In this study, the minimum inhibitory concentrations (MICS) obtained by 2 quantitative methods were compared, the cut-off points used in the colorimetric micromethod (CMM) were established and the antimicrobial susceptibility was evaluated. Materials and Methods: The MIC for nine antibiotics was determined by CMM and broth microdilution (BMD) for 19 strains of M. abscessus complex. The Snedecor F test was used to establish the significant difference in the CIM between the methods, cutoff points were determined by the probability distribution method for the CMM. Discussion: A correlation of 50% between CMM and BMD for antibiotics tested was found. Probably, this discrepancy in the results is due to differences in some technical parameters of each procedure. All strains were susceptible to amikacin and were resistant to meropenem and ampicillin-sulbactam. Independently of the species of M. abscessus complex, fluoroquinolones showed a low inhibitory activity (0-25%) on clinical isolates, results that are similar to those reported by other authors. Conclussion: The Multidrug resistance patterns observed in the strains tested suggest the need for susceptibility testing as tools to guide and optimize the therapeutic behavior in infections caused by M. abscessus.

Resumo Introdução: o complexo Mycobacterium abscessus inclui espécies patógenas emergentes multirresistentes, o qual limita as opções terapêuticas para tratar as infeções causadas por estes microrganismos. Neste estudo compararam-se as concentrações inibitórias mínimas (CIMS) obtidas mediante 2 métodos quantitativos, se estabeleceram os pontos de corte empregados no micrométodo colorimétrico (MMC) e se avaliou a susceptibilidade antimicrobiana. Materiais e métodos: a CIM de 9 antibióticos foi determinada mediante o MMC e microdiluição em caldo (MDC) para 19 cepas do complexo M. abscessus. O teste F de Snedecor utilizou-se para estabelecer a diferença significativa das CIMS entre os dois métodos e determinaram-se os pontos de corte mediante a técnica de distribuição da probabilidade para o MMC. Resultados: se encontrou uma correlação dos resultados da CIM do 50% entre MMC e MDC para os antibióticos testados. Provavelmente, esta discrepância nos resultados se deve a diferenças em alguns parâmetros técnicos de cada procedimento. Todas as cepas foram sensíveis à amikacina e resistentes a meropenem e ampicilina-sulbactam. Independentemente da espécie do complexo M. abscessos, as fluoroquinolonas mostraram uma baixa atividade inibitória (0-25%) sobre os isolados clínicos, resultados que são similares aos reportados por outros autores. Conclussão: Os patrões de multirresistência observados nas cepas analisadas, sugerem a necessidade de utilizar as provas de susceptibilidade como ferramentas que permitam orientar e otimizar as condutas terapêuticas em infeções produzidas por M. abscessus.

Susceptibilidad del género aspergillus a los antifúngicos por el método de microdilución en caldo / Susceptibility of the aspergillus genus to antifungal agents by the broth microdilution method

La aspergilosis es una micosis ocasionada por el género Aspergillus que afecta tanto a pacientes inmunocompetentes como inmunosuprimidos. La presentación clínica depende del estado inmune del hospedero y de los factores de riesgo asociados; en la medida en que progrese la inmunosupresión habrá mayor probabilidad de adquirir la enfermedad invasora que se asocia a una elevada morbimortalidad. El objetivo de este trabajo fue Establecer la susceptibilidad del género Aspergillus a diferentes antifúngicos por el método de Microdilución en caldo según el documento M38-A2, con el fin de conocer los patrones de susceptibilidad de los aislados clínicos de Aspergillus spp. Se utilizaron 76 cepas clínicas que se encuentran en resguardo en la micoteca del Departamento de Micología del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel". Se utilizaron cepas controles A. fumigatus ATCC 204305, A. flavus ATCC 204304, C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei ATCC 6258. Obteniendo como resultado que las CMI más elevadas in vitro frente a las 4 especies de Aspergillus fueron Voriconazol y AmB. Itraconazol y Caspofungina reportaron las CMI más bajas y por consiguiente los PCE obtenidos se encontraron entre más o menos 2 CMI comparadas con otras investigaciones. Este estudio aportó información importante sobre el comportamiento del género Aspergillus frente a los antifúngicos más utilizados en el tratamiento de la aspergilosis en nuestro país como a nivel mundial.

Aspergillosis is a mycosis caused by the genus Aspergillus that affects both immunocompetent and immunosuppressed patients. The clinical presentation depends on the host's immune status and the associated risk factors; As immunosuppression progresses, there is a greater probability of acquiring the invasive disease that is associated with high morbidity and mortality. The objective of this work was to establish the susceptibility of the genus Aspergillus to different antifungals by the method of Microdilution in broth according to document M38-A2, in order to know the susceptibility patterns of the clinical isolates of Aspergillus spp. Seventy-six clinical strains were used in the mycology department of the National Institute of Hygiene "Rafael Rangel". Control strains A. fumigatus ATCC 204305, A. flavus ATCC 204304, C. parapsilosis ATCC 22019 and C. krusei ATCC 6258 were used. As a result, the highest MICs in vitro against the 4 Aspergillus species were Voriconazole and AmB. Itraconazole and Caspofungin reported lower MICs and therefore the PCEs obtained were found between plus or minus 2 MICs compared to other investigations. This study provided important information about the behavior of the genus Aspergillus against the most commonly used antifungals in the treatment of aspergillosis in our country as a worldwide.

Efecto bacteriostático y bactericida de extractos de ají panca (Capsicum chinense) y pimiento (Capsicum annuum var. annuum) sobre cultivos de Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 / Bacteriostatic and bactericidal effect of extracts of red pepper (Capsicum chinense) and pepper (Capsicum annuum var. Annuum) on cultures of Escherichia coli ATCC 25922 and Staphylococcus aureus ATCC 25923

En la actualidad, es creciente el interés por nuevas alternativas para reemplazar los antimicrobianos químicos debido a los efectos adversos para el consumidor. Existen especies botánicas con efecto antimicrobiano como los frutos de Capsicum que son de uso común en nuestro país. Los extractos obtenidos de los ajíes y pimientos poseen compuestos activos con efecto antimicrobiano sobre bacterias, hongos y virus; además, su uso es seguro debido a su naturaleza orgánica. Por ello, el objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad bacteriostática y bactericida de extractos de Ají Panca (Capsicum chinense) y Pimiento (Capsicum annuum var. annuum) sobre Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923. Se elaboró extracto de ambos frutos con rendimientos de 12.53 ± 0.30% y 12.17 ± 0.23% para Ají Panca y Pimiento, respectivamente. Asimismo, el extracto de ají panca contuvo 1.39 mg de capsaicina y 0.54 mg de dihidrocapsaicina, determinadas por HPLC. Estos compuestos no se analizaron para el pimiento ya que los niveles son no detectables en variedades dulces. Se evaluó el efecto de ambos extractos a concentraciones de 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.20, 0.10 y 0.04% usando el método de microdilución en caldo y posterior crecimiento en agares selectivos. Los resultados muestran que no existe efecto bacteriostático para ambas cepas. Asimismo, la viabilidad de E. coli ATCC 25922 no fue afectada por los dos extractos mientras que para S. aureus ATCC 25923 solo el ají panca no afecto su viabilidad. Finalmente, el efecto bactericida para S. aureus ATCC 25923, fue observado con el extracto de pimiento a concentraciones de 25, 12.5 y 6.25%.

Actividad antifúngica de extractos de biomasa celular de neem sobre aislamientos de dermatofitos / Antifungal activity of neem cellular biomass extracts on dermatophytes isolates

Las líneas celulares de neem (Azadirachta indica A. Juss.) cultivadas en suspensión líquida han demostrado producir metabolitos secundarios bioactivos, particularmente triterpenoides. En consecuencia, se han realizado estudios para el control de microorganismos de importancia médica, como los hongos dermatofitos. El objetivo principal de este trabajo fue evaluar a través de un método de referencia in vitro la actividad antifúngica de diferentes extractos de cultivos celulares de neem sobre varios aislamientos de Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum y Epidermophyton floccosum. Se realizó un escalado de cultivos de suspensiones celulares de neem, a partir de los cuales se obtuvo un extracto crudo metanólico. Éste extracto fue fraccionado posteriormente por cromatografía en columna de silica gel. Con los extractos obtenidos se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), siguiendo el método de microdilución en caldo M38-2, con cinco aislamientos de T. mentagrophytes, cinco de T. rubrum y tres de E. floccosum. Se usó como control positivo el antimicótico Terbinafina. Los resultados mostraron que el extracto crudo de biomasa celular de neem inhibe el crecimiento hasta en 100 % de T. mentagrophytes, T. rubrum y E. floccosum. Al evaluar las fracciones por separado, se observó que las de menor polaridad exhibieron en general mayor actividad antifúngica (CMI=109 μg/mL) que el extracto crudo per se (CMI=2500 μg/ mL) y las fracciones más polares (CMI=7000 μg/mL). Lo anterior indica que las células de neem cultivadas en suspensión producen compuestos con actividad antifúngica, siendo más bioactivos los presentes en las fracciones de menor polaridad.

Cell lines of neem (Azadirachta indica A. Juss.) grown in liquid suspension have shown to produce bioactive secondary metabolites, particularly triterpenoids. In consequence, its use as a control of medical microorganisms (like dermatophytes) is proposed. The main goal of this study was to assess the antifungal activity of methanolic extracts from neem cultured cell suspensions on several isolates of Trichophyton mentagrophytes (five isolates), Trichophyton rubrum (five isolates) and Epidermophyton floccosum (three isolates). Neem cell suspension cultures were scaled up, from which a raw methanolic extract was obtained. This extract was fractionated by silica gel column chromatography. The raw methanolic extract and its fractions were used in order to determine the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) on the dermatophytes isolates by following M38-A2 broth microdilution method. Antimycotic Terbinafine was used as positive control. The results shown that neem raw cellular biomass extract inhibits the growth of T. mentagrophytes, T. rubrum and E. floccosum in at least 100%. In the evaluations of the separated fractions, it was observed that the low polarity fractions had higher antifungal activity (MIC=109 μg/mL) than the raw extract per se (MIC=2500 μg/mL) and the most polar ones (MIC=7000 μg/mL). The latter suggest that neem cells cultured in liquid suspension produces compounds with antifungal activity, being more active those present in the low polarity fractions.

Yeasts isolated from nosocomial urinary infections: antifungal susceptibility and biofilm production.

BACKGROUND: Urinary Candida infections in the hospital environment are frequent and need to be better understood. AIMS: To compare the results of antifungal susceptibility profiles of yeasts isolated from patients with urinary infections obtained by broth microdilution method (BM) and by disk diffusion (DD), and also evaluate the capacity of these yeasts to form biofilms. METHODS: Only yeasts obtained from pure urine cultures with counts higher than 10(5) colony-forming units per milliliter, without bacteria development, of symptomatic patients were included. The isolates were identified by classical methods and the antifungal susceptibility tests were performed with the following drugs: amphotericin B, ketoconazole, fluconazole, itraconazole, voriconazole and caspofungin. The biofilm studies were carried out in polystyrene microtitration plates. RESULTS: Ninety-five yeasts isolates were analyzed, including 40 Candida albicans, 31 Candida glabrata, 24 Candida tropicalis. In general, the majority of the isolates were susceptible to the tested drugs but some resistance was observed, especially against fluconazole. Great variability in the antifungal susceptibility results was observed with the different tested drugs and a few discrepancies were observed between both methods. We suggest that in case of DD resistance this result should be confirmed by BM, the standard method. C. tropicalis isolates showed high biofilm production (91.7%) compared to C. albicans (82.5%) and C. glabrata (61.3%), with statistical significance (p=0.0129). CONCLUSIONS: Candiduria in critical patients requires major attention and a better control. The different susceptibility results obtained in this study showed the need to identify yeasts up to the species level, especially in patients with urinary tract infection. The development of techniques of antifungal susceptibility tests can help the clinicians in the empiric treatment of candiduria.

Estudio de la susceptibilidad a los antibióticos de aislados clínicos de Mycobacterium abscessus: Reporte preliminar / Study of antibiotic susceptibility of Mycobacterium abscessus clinical isolates: Preliminary report

Mycobacterium abscessus posee una elevada resistencia a los antibióticos, lo cual limita las opciones terapéuticas para tratar las infecciones causadas por este microorganismo. En este estudio se determinó la susceptibilidad antimicrobiana de 26 cepas de M. abscessus de origen clínico frente a 14 antibióticos, mediante el método de microdilución en caldo (MDC) de acuerdo al procedimiento descrito por el CLSI (2011). Todas las cepas fueron sensibles a la amikacina, seguidas de claritromicina (62%) e imipenem (46%), mientras que el porcentaje de sensibilidad a ciprofloxacina, ampicilina/sulbactam, meropenem, ceftriaxona, amoxacilina y doxiciclina osciló entre 0 y 8%. Nueve diferentes patrones de resistencia fueron observados, representados por la asociación de 4 a 12 antibióticos. La combinación de 8 y 10 marcadores de resistencia constituyeron los patrones más frecuentes (28% cada uno). La amikacina fue el antibiótico con mayor actividad inhibitoria frente a las cepas estudiadas (0,5 - 16 µg/mL). Los patrones de resistencia observados sugieren la necesidad de utilizar las pruebas de susceptibilidad como herramientas que permitan orientar y optimizar las conductas terapéuticas en infecciones producidas por M. abscessus.

Mycobacterium abscessus has a high antibiotic resistance, which limits therapeutic options for treating infections produced by this microorganism. In this study we determined the antimicrobial susceptibility of 26 M. abscessus strain of clinical origin towards 14 antibiotics through the broth microdilution method (BMD) according to the procedure described by the CLSI (2011). All the strains were sensitive to amikacine, followed by clarithromycin (62%), and imipenem (46%), while the percentage sensitivity to ciprofloxacin, ampicillin/sulbactam, meropenem, ceftriaxone, amoxicycillin, and doxicycline varied between 0 and 8%. Nine different resistant patterns were observed, represented by the association of 4 to 12 antibiotics. The combination of 8 and 10 resistance markers constituted the most frequent patterns (28% each). Amikacin was the antibiotic with the highest inhibitory activity towards all the strains studied (0.5 - 16 µg/mL). The resistance patterns observed indicate the need of using susceptibility tests as tools that allow to guide and optimize the therapeutic approach to M. abscessus produced infections.

Susceptibilidad in vitro de candida spp a caspofungina y anfotericina B por los métodos de microdilución en caldo (CLSI), etest y el sistema vitek2. Estudio Comparativo / In vitro susceptibility of candida spp to caspofungin and amphotericin B by broth microdilution methods (CLSI), etest and the vitek2 system. Comparative study

El objetivo de este estudio fue evaluar la susceptibilidad de Candida spp., a caspofungina (CS) y anfotericina B (AMB) por los métodos de microdilución en caldo (CLSI), Etest y sistema automatizado Vitek 2. Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de 208 aislados de Candida spp., obtenidos de pacientes con candidemia, a caspofungina por microdilución en caldo (documento M27-A3 del CLSI) e Etest y a anfotericina B por Etest y Vitek2. Las CMI para Etest y CLSI se leyeron visualmente tras 24 h de incubación a 35°C. El punto final para Vitek 2 fue determinado por el equipo. El punto final de CMI para CS se determinó como la menor concentración que produjo disminución significativa (≥50%) de crecimiento con respecto al control. El punto final para AMB se leyó como la menor concentración que produjo inhibición total (100%) de crecimiento. Se utilizaron las cepas C.parapsilosis ATCC 22019 y C.krusei ATCC 6258 como control de calidad, de acuerdo a las recomendaciones del CLSI. Los métodos Etest y Vitek 2 fueron capaces de detectar aislados susceptibles en todas las cepas evaluadas. Las CMI estuvieron dentro de los valores esperados. Los resultados mostraron buena concordancia esencial (98%) entre microdilución en caldo y Etest y entre Etest y Vitek (65%), Por lo tanto se recomienda su uso en la evaluación de susceptibilidad in vitro a caspofungina y anfotericina B como método alternativo para los laboratorios asistenciales. Se requieren estudios adicionales para verificar la habilidad de Vitek 2 en la identificación de cepas resistentes a AMB y CS

The aim of the study was to test the susceptibility of Candida spp., against caspofungina and amphotericin B with CLSI broth microdilution (BMD), Etest and an automated system Vitek2. We determined the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) from 208 Candida spp. isolates recovered from candidemia patients, to caspofungina and amphotericin B, with broth microdilution (M27-A3 CLSI document), Etest and Vitek. BMD and Etest MICs were read visually after 24 h incubation at 35 ºC. Vitek2 endpoints were determined spectrophotometrically by automated components of this equipment. Caspofungina MIC endpoint was determined as the lowest concentration that caused a significant diminution ≥50% of growth below the growth control. Amphotericin B MIC endpoint was read as the lowest concentration that produced the complete inhibition (100%) of growth. Quality control was performed by testing CLSI recommended strains C. parapsilosis ATCC 22019 and C. krusei ATCC 6258. Etest and Vitek methods were able to detect susceptible isolates in all strains tested. MICs were within expected values. Values of essential agreement were good: 98% between CLSI and Etest and 65% between Vitek and Etest. Therefore, they are recommended to test in vitro susceptibility to caspofungina and amphotericin B as a reliable alternative method for using in clinical laboratories. More studies are necessary to verify Vitek´s 2 ability to identify resistance isolates to amphotericin B.

Susceptibilidad in vitro de candida spp., a fluconazol y voriconazol, por los métodos de microdilución en caldo, etest y sistema automatizado vitek 2. Estudio Comparativo / In vitro susceotibility of candida spp., to fluconazole and voriconazole, by the methods of broth microdilution, etest and automated systems vitek 2. Comparative study

La candidiasis invasora (CI) representa la cuarta causa de infección nosocomial a nivel mundial, con una tasa de mortalidad por candidemia entre el 25 y 38%. Se reporta un cambio epidemiológico, en las especies de Candida, de tal forma que la C. albicans (20.7%) fue desplazada por el grupo de Candida no albicans, C. parapsilosis ocupa el primer lugar (44,2%). Es importante conocer y vigilar los cambios de susceptibilidad de Candida spp., a los antifúngicos de uso sistémico a través de técnicas apropiadas y útiles en el laboratorio clínico, para instaurar una terapia antifúngica oportuna. En este estudio se evaluaron 208 cepas de Candida spp., provenientes de la Red de candidemia y vigilancia de la resistencia de los antifúngicos del INHRR, determinando la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) a fluconazol y voriconazol por los métodos de microdilución en caldo (CLSI), Etest y sistema automatizado Vitek 2; siguiendo los procedimientos descritos según los documentos y/o técnicas del fabricante M27-A3 (CLSI), Etest y Vitek 2 respectivamente. Se utilizaron las cepas C.parapsilosis ATCC 22019 y C.krusei ATCC 6258 como control de calidad. Los aislados fueron 100% sensibles para voriconazol por CLSI y Etest; y 99.5% por VITEK 2. El 92.8% de las cepas fueron sensibles por CLSI, 95.2% por Etest y 95.7% por Vitek 2 para fluconazol. Se obtuvo una Especificidad y Concordancia del 100% para Voriconazol por Etest y 99.5% por Vitek 2. Para fluconazol la concordancia fue de 95.6% por Etest y 94.23% por Vitek 2, y una p≤ 0.05.La concordancia entre el método de Etest y Vitek 2 fue de 96%. Se obtuvo una excelente concordancia entre los métodos evaluados, de manera que pueden ser utilizados indistintamente en la detección de susceptibilidad y/o resistencia antifúngica.

Invasive Candidiasis(IC) represents the fourth most common cause of nosocomial infection worldwide with a mortality rate of candidemia between 25 and 38%. A epidemiological shift so that the C. albicans (20.7%) have been displaced by the Candida no albicans group, C. parapsilosis is most common species (44, 2%). It is important to know and to monitor changes in susceptibility of Candida spp. To systemic antifungal, with use of appropriate techniques in the clinical laboratory, because of the to establish a early antifungal therapy. This study evaluated 208 strains of Candida spp. Surveillance program of Candidemia from the INHRR, determining the minimum inhibitory concentration (MIC) to fluconazole and voriconazole by the broth microdilution methods (CLSI), Etest and Vitek 2 automated system, following the procedure contained in document M27-A3 (CLSI), and the procedure described by the manufacturer to the other methods. Were used strains as quality control C. parapsilosis ATCC 22019 and C.krusei ATCC 6258? The isolates were 100% susceptible to Voriconazole by CLSI and Etest and 99.5% for VITEK 2. The 92.8% of the strains were susceptibility to fluconazol for CLSI, 95.2% by Etest and 95.7% for Vitek2. Specificity and categorical agreement was100% for Voriconazole by Etest and 99.5% for Vitek 2. For fluconazole the agreement was 95.6% by Etest and 94.23% for Vitek 2, McNemar index <3.8 and p ≤ 0.05.The categorical agreement between the Etest method and Vitek 2 was 96%. CONCLUSION: There is a excellent agreement between the methods evaluated, so that can be used interchangeably in the detection of antifungal susceptibilitytesting.