Caracterização da letalidade dos venenos de serpentes Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus, por meio de ensaio em ovos embrionados de galinha

Em 2017, a Organização Mundial da Saúde voltou a considerar o ofidismo como uma doença tropical negligenciada de maior prioridade. As serpentes do gênero Bothrops têm destaque por serem responsáveis por mais de 90% dos acidentes ocorridos no Brasil. Já o gênero Crotalus apresenta um percentual de 7,7%, com letalidade maior nos acidentes crotálicos (1,87%) (Fundação Nacional de Saúde, 1988). O ensaio em ovos embrionados de galinha (OEG), representa um modelo in vivo, alternativo ao teste convencional em camundongos para teste de letalidade, sendo um método bastante eficaz e versátil para estudos pré-clínicos, podendo também atuar de forma complementar aos testes in vitro. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo analisar, por meio de ensaio em OEG, a determinação da letalidade induzida pelos venenos, obtidos do laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan de Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus. Foi feita a avaliação da aplicabilidade de doses desafio desses venenos para calcular a dose letal 50% (DL50). Nesta pesquisa, foram utilizados 300 ovos fertilizados de galinhas da linhagem Novogen White, SPF, em embriões de 6 e 7 dias de desenvolvimento. Os OEG foram incubados a 37oC e 62% de umidade relativa até o momento de inoculação. Nos OEG, foram inoculados na cavidade alantoide, os venenos de B. jararaca (VBj) as concentrações de VBj: 84,2 μg a 2,63125 μg/ovo e C. durissus terrificus (VCdt) as concentrações de VCdt: 5,74 μg a 0,179375 μg/ovo, tendo como grupos controles o crescimento de ovos sem qualquer inoculação (GC) e controles inoculados com salina (GS) em paralelo. Os embriões foram analisados por meio de ovoscopia manual, após os tempos de incubação, nos intervalos de 24 horas e 48 horas, para avaliação da função vascular. Foi realizada a inspeção macroscópica das lesões dos embriões mortos e registro fotográfico. Os resultados obtidos de dose letal 50% (DL50) em OEG no teste de VCdt foram de DL50=0,8035 μg/ovo nos embriões de 6 dias e DL50=0,09113 μg/ovo nos embriões de 7 dias de desenvolvimento. Já o teste para VBj os valores estimados de DL50 foram de DL50=21,91 μg/ovos nos embriões de 6 dias e DL50=24,37 μg /ovo em embriões de 7 dias de vida embrionária. Os valores de DL50 obtidos em OEG ao serem comparados com os valores de DL50 em camundongos, demostraram ter boa correspondência entres as metodologias. A partir do uso dessa técnica, verificou-se que os OEG podem ser utilizados como alternativo ao método convencional em camundongos.

Estudo do rendimento viral na produção da vacina influenza, com base no uso de ovos de galinha embrionados com diferentes idades

This experimental study proposes to carry out a data collection regarding the viral yield of the production of the monovalent influenza virus, using embryonated chicken eggs with different ages. Considering that it is an experimental work, the main justification for its realization is the constant search for the improvement of industrial production processes, specifically, the possibility of increasing the production capacity of the factory of monovalent influenza viruses. For this, the determination of the best embryonic age will enhance a greater replication of the viral population existing in the microenvironment of the egg surrounding the embryo. All stages of the study procedures, which included the use of various modern equipment and laboratory materials, as well as specific reagents inherent to the process, were in accordance with the parameters established by the Quality Assurance department of the Butantan Institute, being in-process controls essential for the different stages of the artificial incubation stage of embryonated chicken eggs. Embryonated chicken eggs aged between 37 and 44 weeks, strains B/Phuket/3073/2013, B/Austria/1359417/2021, A/Darwin/9/2021, respectively, were used, totaling 9,000 (nine thousand) eggs with 9 (nine), 10 (ten), 11 (eleven) and 12 (twelve) day-old embryos for interpretation of the respective statistical data. The study was carried out in the Laboratory for the Production of Influenza Banks (PBI) building, since it was in compliance with regard to the nature of the laboratory activities monitored by the Institution's support disciplines, as well as being in line with the Good Laboratory Practices, Good Manufacturing Practices and Good Biosafety Practices. The eggs were incubated in specific artificial incubation machines and subjected to a temperature range between 33°C and 35°C, as well as a humidity of approximately 55%, which were the in-process controls chosen for effective viral replication and subjected to following unit operations: receipt of eggs, primary candling, primary incubation, preparation of viral inoculum, test of hemagglutinating units of viral inoculum, viral inoculation, secondary incubation, secondary candling, primary cooling, collection of Allantoic Liquid, secondary cooling, sample purification , determination of sucrose content, UHA and Optical Density of 14 purified samples. The results of this experimental study were submitted to statistical analysis to enhance discussions about the implementation of the use of embryonated chicken eggs, with 11 days and/or 12 days of life, better viral yields found, as strategies to establish new specifications of embryonated eggs, as raw material for the production process.

Este estudo experimental propõe a realização de um levantamento de dados no tocante ao rendimento viral da produção do monovalente do vírus influenza, utilizando ovos de galinha embrionados e com diferentes idades. Considerando que é um trabalho experimental, a principal justificativa para sua realização é pela constante busca do aperfeiçoamento dos processos produtivos industriais, especificamente, na possibilidade de aumentar a capacidade produtiva da fábrica de monovalentes de vírus influenza. Para isto, a determinação da melhor idade embrionária potencializará uma maior replicação da população viral existente no microambiente do ovo circundante ao embrião. Todas as etapas dos procedimentos do estudo, que contou com a utilização de diversos equipamentos modernos e materiais laboratoriais, bem como reagentes específicos inerentes ao processo, estavam em conformidade com os parâmetros estabelecidos pelo departamento de Garantia da Qualidade do Instituto Butantan, sendo controles em processo essenciais para os diferentes estágios da etapa de incubação artificial dos ovos de galinha embrionados. Foram utilizados ovos embrionados de galinha com idades entre 37 e 44 semanas, das cepas B/Phuket/3073/2013, B/Austria/1359417/2021, A/Darwin/9/2021, respectivamente, totalizando 9.000 (nove mil) ovos com embriões de 9 (nove), 10 (dez), 11 (onze) e 12 (doze) dias de idade para interpretação dos respectivos dados estatísticos. O estudo foi realizado no prédio do Laboratório da Produção de Bancos Influenza (PBI), uma vez que estava dentro da conformidade no tocante a natureza das atividades de cunho laboratorial acompanhadas pelas disciplinas de apoio da Instituição, assim como mantinham-se em consonância com as Boas Práticas de Laboratório, Boas Práticas de Fabricação e Boas Práticas de Biossegurança. Os ovos foram incubados em máquinas específicas de incubação artificial e submetidos ao range de temperatura compreendido entre 33°C e 35°C, bem como a umidade de aproximadamente 55%, que foram os controles em processo escolhidos para a efetiva replicação viral e submetidos às seguintes operações unitárias: recebimento dos ovos, ovoscopia primária, incubação primária, preparo do inóculo viral, teste de unidades 12 hemaglutinantes do inóculo viral, inoculação viral, incubação secundária, ovoscopia secundária, resfriamento primário, colheita do Líquido Alantóico, resfriamento secundário, purificação das amostras, determinação do teor de sacarose, UHA e Densidade Óptica das amostras purificadas. Os resultados deste estudo experimental foram submetidos a análises estatísticas para potencializar as discussões sobre a implementação do uso de ovos de galinha embrionados, com 11 dias e/ou 12 dias de vida, melhores rendimentos virais encontrados, como estratégias para estabelecer novas especificações dos ovos embrionados, na condição de matéria prima para o processo produtivo.

Isolamento e propagação de Astrovírus, Adenovírus, Coronavírus, Parvovírus, Rotavírus e Reovírus de aves comerciais com problemas entéricos em ovos embrionados / Isolation and propagation of Astrovirus, Adenovirus, Coronavirus, Parvovirus, Rotavirus and Reovirus from commercial poultry with enteric problems in embryonated eggs

Os ovos embrionados são estruturas complexas compostas pelo embrião e as membranas de suporte (corioalantóide, amniótica, gema). O desenvolvimento embrionário e suas membranas geram diversos tipos de células que são necessárias para a replicação bem sucedida de uma grande variedade de vírus. Dentre os vírus entéricos, os ovos embrionados foram usados como o principal hospedeiro para o isolamento, cultivo e propagação da grande maioria destes. O presente trabalho descreve o isolamento, cultivo e propagação em ovos embrionados livres de patógenos específicos (SPF), assim como a caracterização macroscópica do vírus relacionado com problemas entéricos em lotes de aves comerciais no Brasil. Amostras intestinais provenientes de galinhas ou frangos de corte sadias ou com problemas entéricos (diarreia) e que se apresentaram positivas, através da reação em cadeia pela polimerase (PCR) e da técnica da trancriptase reversa da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR), para Astrovírus de Galinha, Parvovírus de Galinha, Vírus da Nefrite Aviária, Rotavírus Aviário, Reovírus Aviário, Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas e Adenovírus Aviário Tipo 1 foram selecionadas para a realização do isolamento, cultivo e propagação em ovos embrionados SPF. Mortalidade e lesões macroscópicas como hemorragias, edema, nanismo, enrolamento, aspecto gelatinoso e deformações foram encontradas nos embriões, porém as membranas de suporte do ovo não apresentaram alteração. A confirmação viral nas passagens nos ovos foi realizada mediante o uso da PCR ou RT-PCR. Houve a replicação de Astrovírus de galinha, Vírus da Nefrite Aviária, Adenovírus Aviário do Tipo 1, Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas, Parvovírus de Galinha e Reovírus Aviário nos ovos embrionados SPF, inoculados via saco da gema, aos sete dias de idade. No entanto, estes vírus também foram isolados em ovos embrionados de 14 dias de idade. A inoculação pelo saco da gema se mostrou uma ótima via para o isolamento viral. Foram isoladas duas amostras de Parvovírus de Galinha, oito amostras de Astrovírus de Galinha, sete amostras do Vírus da Bronquite das Galinhas, dezesseis amostras de Vírus da Nefrite Aviária, onze amostras de Adenovírus Aviário do Tipo 1 e três amostras de Reovírus Aviário. Nenhuma amostra de Rotavírus Aviário foi isolada. As características macroscópicas apresentadas nos embriões fo...

The embryonated eggs are complex structures composed by embryo and support membranes (yolk sac, chorioallantoic membrane, amniotic sac). The embryo development and their membranes produced many kinds of cells that are necessary for successful replication of many viruses. Between the enteric viruses, the embryonated eggs have been used as the principal host for isolation, culture and propagation of many of these viruses. The present work describes the isolation, culture, propagation and macroscopic characterization of astrovírus, adenovirus, coronavirus, parvovirus, reovírus e rotavirus, related to enteric problems in commercial flows at Brazil in chicken embryonated eggs specific pathogens free (SPF). Intestinal samples from hens or chickens health or with enteric problems (diarrhea), but showed positive for chicken astrovírus, chicken parvovirus, avian nephritis vírus, avian rotavirus, avian reovirus, bronchitis infectious vírus and fowl adenovirus type 1, through PCR and RT-PRC reactions, were selected for making of isolation, culture and propagation in chicken embryonated eggs specific pathogens free (SPF). Mortality and macroscopic lesions presented in the embryos characterized by hemorrhages, edemas, stunting, enrollment, gelatin features and deformations, however the support membranes not presented any damaged. The viral confirmation in the eggs passages was carry out using the polymerase chain reaction and transcriptase reverse of the polymerase chain reaction. Chicken astrovírus, avian nephritis vírus, fowl adenovirus type 1, bronchitis infectious vírus, chicken parvovirus and avian reovírus grow well in chickens embryonated eggs specific pathogen free SPF, inoculated in the yolk sac on seven days-old, however these viruses were isolated in embryonated eggs of fourteen days-old, too. The inoculation by yolk sac resulted be a optimal route for viral isolation, getting isolate two samples of chicken parvovirus, eight samples of chicken astrovirus, seven samples of bronchitis infectious vírus, sixteen samples of avian nephritis vírus, eleven samples of fowl adenovirus type one and three samples of avian reovirus, but any samples was isolated for avian rotavirus. The macroscopic characteristics presented in the embryos were similar in all of isolated viruses. Many samples used not present lesions and were negative in the molecular d...

Propolis: a natural product as an alternative por disinfection of embryonated eggs for incubation / Propolis: um produto natural como alternativa para desinfecção de pbps embrionados para incubação

During the cooling process of embryonated eggs, there is a natural air flux from the surface to the inner part of the eggs, carrying contaminants such as bacteria and fungi through the shells pores, infecting embryos and resulting in the inability to hatch or poor chick quality. Formaldehyde, a toxic product, is still the most used disinfectant for embryonated eggs in the aviculture industry. In order to evaluate the antimicrobial activity of the green propolis ethanolic extract as an alternative to formaldehyde, 140 hatching eggs from laying hens were collected and submitted to disinfection with five different treatments: T1 - without disinfection; T2 - formaldehyde fumigated eggs; T3, T4 and T5 disinfection by immersion in propolis solution in the concentrations of 2,400 μg, 240 μg and 24 μg, respectively. The contamination levels by total mesophiles and fungi of the egg shells (Aspergillus sp. and other moulds) after disinfection with propolis were lower than when compared to the control without disinfection. In comparison with formaldehyde, the 240 μg and 24 μg propolis concentrations did not differ regarding antibacterial activity, but for antifungal activity the 2,400 μg and 240 μg concentrations were more efficient. The 2,400 μg and 240 μg propolis treatments presented a hatching rate of 94.1%, compared to only 84.6% for the formaldehyde treatment. The green propolis ethanolic extract presented antibacterial and antifungal activities in embryonated eggs showing that it can be a new natural disinfectant product substituting formaldehyde.(AU)

Durante o processo de resfriamento dos ovos embrionados, há um fluxo natural de ar da superfície para o interior dos ovos carreando contaminantes como bactérias e fungos, por meio dos poros da casca, infectando o embrião e resultando na inabilidade para eclodir e pintinhos de má qualidade. O formaldeído que é um produto tóxico ainda é o desinfetante mais utilizado para a desinfecção de ovos embrionados pela indústria avícola. Para avaliar a atividade antimicrobiana do extrato etanólico da própolis verde, como alternativa ao formaldeído, foram coletados 140 ovos de ninhos de matrizes de frango de corte submetidos à desinfecção com cinco tratamentos: T1 - sem desinfecção; T2 - ovos fumigados com formaldeído; T3, T4 e T5 desinfetados por imersão com solução de própolis nas concentrações de 2.400 μg, 240 μg e 24 μg, respectivamente. Os níveis de contaminação da casca dos ovos por mesófilos totais e fungos (Aspergillus e outros bolores), após a desinfecção com própolis, foram menores quando comparados ao controle. Na comparação ao tratamento com formaldeído as concentrações de própolis com 240 μg e 24 μg não diferiram para atividade antibacteriana, já para atividade antifúngica, 2,4 mg e 240 μg foram superiores. Com relação à eclodibilidade dos ovos, após 21 dias de incubação, os tratamentos de própolis (2,4 mg e 240 μg) apresentaram as maiores taxas com 94,11% superando o tratamento com formaldeído. Portanto, o extrato etanólico de própolis verde apresenta atividade antibacteriana e antifúngica em ovos embrionados podendo ser um novo produto natural desinfetante em substituição ao formaldeído.(AU)

Propolis: a natural product as an alternative for disinfection of embryonated eggs for incubation

During the cooling process of embryonated eggs, there is a natural air flux from the surface to the inner part of the eggs, carrying contaminants such as bacteria and fungi through the shell's pores, infecting embryos and resulting in the inability to hatch or poor chick quality. Formaldehyde, a toxic product, is still the most used disinfectant for embryonated eggs in the aviculture industry. In order to evaluate the antimicrobial activity of the green propolis ethanolic extract as an alternative to formaldehyde, 140 hatching eggs from laying hens were collected and submitted to disinfection with five different treatments: T1 - without disinfection; T2 - formaldehyde fumigated eggs; T3, T4 and T5 disinfection by immersion in propolis solution in the concentrations of 2,400 µg, 240 µg and 24 µg, respectively. The contamination levels by total mesophiles and fungi of the egg shells (Aspergillus sp. and other moulds) after disinfection with propolis were lower than when compared to the control without disinfection. In comparison with formaldehyde, the 240 µg and 24 µg propolis concentrations did not differ regarding antibacterial activity, but for antifungal activity the 2,400 µg and 240 µg concentrations were more efficient. The 2,400 µg and 240 µg propolis treatments presented a hatching rate of 94.1%, compared to only 84.6% for the formaldehyde treatment. The green propolis ethanolic extract presented antibacterial and antifungal activities in embryonated eggs showing that it can be a new natural disinfectant product substituting formaldehyde.

Durante o processo de resfriamento dos ovos embrionados, há um fluxo natural de ar da superfície para o interior dos ovos carreando contaminantes como bactérias e fungos, por meio dos poros da casca, infectando o embrião e resultando na inabilidade para eclodir e pintinhos de má qualidade. O formaldeído que é um produto tóxico ainda é o desinfetante mais utilizado para a desinfecção de ovos embrionados pela indústria avícola. Para avaliar a atividade antimicrobiana do extrato etanólico da própolis verde, como alternativa ao formaldeído, foram coletados 140 ovos de ninhos de matrizes de frango de corte submetidos à desinfecção com cinco tratamentos: T1 - sem desinfecção; T2 - ovos fumigados com formaldeído; T3, T4 e T5 desinfetados por imersão com solução de própolis nas concentrações de 2.400 µg, 240 µg e 24 µg, respectivamente. Os níveis de contaminação da casca dos ovos por mesófilos totais e fungos (Aspergillus e outros bolores), após a desinfecção com própolis, foram menores quando comparados ao controle. Na comparação ao tratamento com formaldeído as concentrações de própolis com 240 µg e 24 µg não diferiram para atividade antibacteriana, já para atividade antifúngica, 2,4 mg e 240 µg foram superiores. Com relação à eclodibilidade dos ovos, após 21 dias de incubação, os tratamentos de própolis (2,4 mg e 240 µg) apresentaram as maiores taxas com 94,11% superando o tratamento com formaldeído. Portanto, o extrato etanólico de própolis verde apresenta atividade antibacteriana e antifúngica em ovos embrionados podendo ser um novo produto natural desinfetante em substituição ao formaldeído.

Propolis: a natural product as an alternative por disinfection of embryonated eggs for incubation / Propolis: um produto natural como alternativa para desinfecção de pbps embrionados para incubação

During the cooling process of embryonated eggs, there is a natural air flux from the surface to the inner part of the eggs, carrying contaminants such as bacteria and fungi through the shell’s pores, infecting embryos and resulting in the inability to hatch or poor chick quality. Formaldehyde, a toxic product, is still the most used disinfectant for embryonated eggs in the aviculture industry. In order to evaluate the antimicrobial activity of the green propolis ethanolic extract as an alternative to formaldehyde, 140 hatching eggs from laying hens were collected and submitted to disinfection with five different treatments: T1 - without disinfection; T2 - formaldehyde fumigated eggs; T3, T4 and T5 disinfection by immersion in propolis solution in the concentrations of 2,400 μg, 240 μg and 24 μg, respectively. The contamination levels by total mesophiles and fungi of the egg shells (Aspergillus sp. and other moulds) after disinfection with propolis were lower than when compared to the control without disinfection. In comparison with formaldehyde, the 240 μg and 24 μg propolis concentrations did not differ regarding antibacterial activity, but for antifungal activity the 2,400 μg and 240 μg concentrations were more efficient. The 2,400 μg and 240 μg propolis treatments presented a hatching rate of 94.1%, compared to only 84.6% for the formaldehyde treatment. The green propolis ethanolic extract presented antibacterial and antifungal activities in embryonated eggs showing that it can be a new natural disinfectant product substituting formaldehyde.

Durante o processo de resfriamento dos ovos embrionados, há um fluxo natural de ar da superfície para o interior dos ovos carreando contaminantes como bactérias e fungos, por meio dos poros da casca, infectando o embrião e resultando na inabilidade para eclodir e pintinhos de má qualidade. O formaldeído que é um produto tóxico ainda é o desinfetante mais utilizado para a desinfecção de ovos embrionados pela indústria avícola. Para avaliar a atividade antimicrobiana do extrato etanólico da própolis verde, como alternativa ao formaldeído, foram coletados 140 ovos de ninhos de matrizes de frango de corte submetidos à desinfecção com cinco tratamentos: T1 - sem desinfecção; T2 - ovos fumigados com formaldeído; T3, T4 e T5 desinfetados por imersão com solução de própolis nas concentrações de 2.400 μg, 240 μg e 24 μg, respectivamente. Os níveis de contaminação da casca dos ovos por mesófilos totais e fungos (Aspergillus e outros bolores), após a desinfecção com própolis, foram menores quando comparados ao controle. Na comparação ao tratamento com formaldeído as concentrações de própolis com 240 μg e 24 μg não diferiram para atividade antibacteriana, já para atividade antifúngica, 2,4 mg e 240 μg foram superiores. Com relação à eclodibilidade dos ovos, após 21 dias de incubação, os tratamentos de própolis (2,4 mg e 240 μg) apresentaram as maiores taxas com 94,11% superando o tratamento com formaldeído. Portanto, o extrato etanólico de própolis verde apresenta atividade antibacteriana e antifúngica em ovos embrionados podendo ser um novo produto natural desinfetante em substituição ao formaldeído.

Protein profile in freeze-dried chicken embryo eggs with different periods of development / Perfil protéico em ovos embrionados e liofilizados de galinha com diferentes dias de desenvolvimento

This article presents the protein profile in freeze-dried chicken embryo eggs with different development periods (0, 3, 5, 7, 9, 11 days). The protein profile was determined through HPLC-reverse phase, electrophoresis SDS-PAGE and IFE-electrophoresis. Protein profile of these eggs changes according to the period of development and the change is more evident after the 5th day, where there was an increase in ovalbumin, ovotransferrin, apoLDL, apoHDL and lysozyme concentration, and a decrease in ovomucin and ovostatin concentration. The hypothesis that the change in the protein profile is due to protein biosynthesis and disintegration that happens during incubation process is discussed.

Este artigo mostra o perfil protéico em ovos de galinha embrionados e liofilizados com diferentes períodos de desenvolvimento (0, 3, 5, 7, 9, 11 dias). O perfil protéico foi determinado por CLAE-fase reversa, eletroforese SDS-PAGE e eletroforese de focalização isoelétrica. O perfil protéico destes ovos não é igual, sendo que a diferença fica mais evidente a partir do 5º dia de desenvolvimento onde há um aumento da concentração das proteínas ovalbumina, ovotransferrina, apoLDL, apoHDL e lisozima, e diminuição da concentração da ovomucina e ovostatina, por estarem associadas ao desenvolvimento de tecidos e órgãos embrionários.

Protein profile in freeze-dried chicken embryo eggs with different periods of development / Perfil protéico em ovos embrionados e liofilizados de galinha com diferentes dias de desenvolvimento

This article presents the protein profile in freeze-dried chicken embryo eggs with different development periods (0, 3, 5, 7, 9, 11 days). The protein profile was determined through HPLC-reverse phase, electrophoresis SDS-PAGE and IFE-electrophoresis. Protein profile of these eggs changes according to the period of development and the change is more evident after the 5th day, where there was an increase in ovalbumin, ovotransferrin, apoLDL, apoHDL and lysozyme concentration, and a decrease in ovomucin and ovostatin concentration. The hypothesis that the change in the protein profile is due to protein biosynthesis and disintegration that happens during incubation process is discussed.

Este artigo mostra o perfil protéico em ovos de galinha embrionados e liofilizados com diferentes períodos de desenvolvimento (0, 3, 5, 7, 9, 11 dias). O perfil protéico foi determinado por CLAE-fase reversa, eletroforese SDS-PAGE e eletroforese de focalização isoelétrica. O perfil protéico destes ovos não é igual, sendo que a diferença fica mais evidente a partir do 5º dia de desenvolvimento onde há um aumento da concentração das proteínas ovalbumina, ovotransferrina, apoLDL, apoHDL e lisozima, e diminuição da concentração da ovomucina e ovostatina, por estarem associadas ao desenvolvimento de tecidos e órgãos embrionários.