The effect of adjusting settings within a Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA) system on bovine sperm motility and morphology results.

Semen motility is the most widely recognized semen quality parameter used by Artificial Insemination (AI) centers. With the increasing worldwide export of semen between AI centers there is an increasing need for standardized motility assessment methods. Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA) technology is thought to provide an objective motility evaluation; however, results can still vary between laboratories. The aim of present study was to verify the impact of different setting values of the CASA IVOS II on motility, concentration, and morphology of bovine semen samples frozen in an extender with or without egg yolk and then decide on optimal settings for a further validation step across AI centers. Semen straws from 30 different bulls were analyzed using IVOS II with twelve modified settings. No significant changes were observed in semen concentration, percentage of motile sperm or kinetic results for either extender type. However, increasing settings for both STR and VAP progressive (%) from Low, Medium, and High cut-off values significantly (p<0.05) reduced the percentage of detected progressive spermatozoa, in egg yolk extender from 49.5±15.2, 37.2±11.9 to 11.9±5.3%, and in clear extender from 51.9±9.1, 35.8±7.3 to 10.0±2.4%, respectively. In clear extender only, the modification of droplet proximal head length significantly affected the detection of normal sperm percentages (88.0± 4.7 to 95.0±0.6 and 96.0±0.6%) and of the percentage of detected proximal droplets (12.2±4.7, 2.5±2.7 to 0.6±0.2%) for Low, Medium and High values respectively (p<0.05). The identification of sensitivity within the CASA system to changes in set parameters then led to the determination of an optimal IVOS II setting. The existing variability among centers for these phenotypes was reduced when the standardized settings were applied across different CASA units. The results clearly show the importance of applied settings for the final CASA results and emphasize the need for standardized settings to obtain comparable data.

The effect of adjusting settings within a Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA) system on bovine sperm motility and morphology results

Abstract Semen motility is the most widely recognized semen quality parameter used by Artificial Insemination (AI) centers. With the increasing worldwide export of semen between AI centers there is an increasing need for standardized motility assessment methods. Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA) technology is thought to provide an objective motility evaluation; however, results can still vary between laboratories. The aim of present study was to verify the impact of different setting values of the CASA IVOS II on motility, concentration, and morphology of bovine semen samples frozen in an extender with or without egg yolk and then decide on optimal settings for a further validation step across AI centers. Semen straws from 30 different bulls were analyzed using IVOS II with twelve modified settings. No significant changes were observed in semen concentration, percentage of motile sperm or kinetic results for either extender type. However, increasing settings for both STR and VAP progressive (%) from Low, Medium, and High cut-off values significantly (p<0.05) reduced the percentage of detected progressive spermatozoa, in egg yolk extender from 49.5±15.2, 37.2±11.9 to 11.9±5.3%, and in clear extender from 51.9±9.1, 35.8±7.3 to 10.0±2.4%, respectively. In clear extender only, the modification of droplet proximal head length significantly affected the detection of normal sperm percentages (88.0± 4.7 to 95.0±0.6 and 96.0±0.6%) and of the percentage of detected proximal droplets (12.2±4.7, 2.5±2.7 to 0.6±0.2%) for Low, Medium and High values respectively (p<0.05). The identification of sensitivity within the CASA system to changes in set parameters then led to the determination of an optimal IVOS II setting. The existing variability among centers for these phenotypes was reduced when the standardized settings were applied across different CASA units. The results clearly show the importance of applied settings for the final CASA results and emphasize the need for standardized settings to obtain comparable data.

The effect of adjusting settings within a ComputerAssisted Sperm Analysis (CASA) system on bovine sperm motility and morphology results

Semen motility is the most widely recognized semen quality parameter used by Artificial Insemination (AI) centers. With the increasing worldwide export of semen between AI centers there is an increasing need for standardized motility assessment methods. Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA) technology is thought to provide an objective motility evaluation; however, results can still vary between laboratories. The aim of present study was to verify the impact of different setting values of the CASA IVOS II on motility, concentration, and morphology of bovine semen samples frozen in an extender with or without egg yolk and then decide on optimal settings for a further validation step across AI centers. Semen straws from 30 different bulls were analyzed using IVOS II with twelve modified settings. No significant changes were observed in semen concentration, percentage of motile sperm or kinetic results for either extender type. However, increasing settings for both STR and VAP progressive (%) from Low, Medium, and High cut-off values significantly (p<0.05) reduced the percentage of detected progressive spermatozoa, in egg yolk extender from 49.5±15.2, 37.2±11.9 to 11.9±5.3%, and in clear extender from 51.9±9.1, 35.8±7.3 to 10.0±2.4%, respectively. In clear extender only, the modification of droplet proximal head length significantly affected the detection of normal sperm percentages (88.0± 4.7 to 95.0±0.6 and 96.0±0.6%) and of the percentage of detected proximal droplets (12.2±4.7, 2.5±2.7 to 0.6±0.2%) for Low, Medium and High values respectively (p<0.05). The identification of sensitivity within the CASA system to changes in set parameters then led to the determination of an optimal IVOS II setting. The existing variability among centers for these phenotypes was reduced when the standardized settings were applied across different CASA units. The results clearly show the importance of applied settings for the final CASA results and emphasize the need for standardized settings to obtain comparable data.(AU)

Bovine seminal plasma osteopontin: Structural modelling, recombinant expression and its relationship with semen quality.

Osteopontin (OPN) is a multifunctional phosphoprotein that has been linked to fertility in bulls. However, the exact mechanism by which OPN contributes to fertilisation is yet unknown. The biotechnological use of OPN in bovine reproduction is promising but some gaps remain unfilled. The present work aimed: (a) to verify whether the seminal plasma OPN is associated with seminal traits and a standard breeding soundness exam; (b) to predict OPN interactions with integrins, CD44 and glycosaminoglycans through molecular docking; and (c) to develop a protocol for recombinant expression of OPN from vesicular gland cDNA. Ejaculates from top ranked bulls had higher amounts of seminal plasma OPN in comparison with bulls classified as questionable (p < .01). The structural modelling and molecular docking predictions indicated that bovine OPN binds to heparin disaccharide, hyaluronic acid and hyaluronan. In addition, docking studies described the binding complexes of OPN with CD44 and the integrin heterodimers α5ß1 and αVß3. Finally, expression of rOPN-6His was successfully obtained after 3 hr of induction with 0.5 mM IPTG at 37°C and a denaturing purification protocol resulted in efficiently purified recombinant OPN. The present results contribute to the development of biotechnological uses of OPN as a biomarker in bovine reproduction.

Peptide derivatives of dermaseptin S4 in fresh bovine semen for bacterial contamination control: Physicochemical and structural characterization, antibacterial potency, and effects on red blood and sperm cells.

The objectives of this study were to examine the physicochemical and structural properties of peptide derivatives of dermaseptin S4, investigate their detrimental effects on red blood and sperm cells and ascertain their antibacterial potency to control bacterial contaminants in fresh bovine semen. The dermaseptin S4 peptide derivatives used in this study were K4S4, S4(5-28), S4(5-28)a, K20S4(5-28), K4S4(1-16)a, K4S4(1-15)a and K4S4(1-15). Peptides K4S4, S4(5-28)a, K20S4(5-28), K4S4(1-15)a and K4S4(1-16)a, with a higher positive charge, were the most potent against the bacterial strains tested, with the lowest minimum inhibitory concentration (MIC), whereas S4(5-28) and K4S4(1-15), with a lower positive charge, showed the highest MIC (p < .01). Haemolysis percentage depended on peptide concentration (p < .01). The K4S4 was the most powerful haemolytic peptide, showing the highest haemolysis percentage at all peptide concentrations (p < .01). In contrast, S4(5-28), S4(5-28)a, K20S4(5-28) and K4S4(1-15) were not able to produce 50% cell lysis up to 100 µM (p < .01). All peptides reduced sperm motility in a dose-dependent manner when used in concentrations from 16 to 64 µM (p < .01). The highest reduction was seen due to K4S4 activity, and the lowest reductions of sperm motility were observed due to K4S4(1-16)a and K4S4(1-15)a activity (p < .01). Hence, we can conclude that K4S4(1-16)a and K4S4(1-15)a at a concentration of approximately 15 µM are the most promising peptides as antibacterial agents in fresh bovine semen, because at this concentration, they showed the most potent antibacterial activity against evaluated strains without significant effects on haemolysis or a reduction in sperm motility.

Projeto Mais Precoce Embrapa: aumentar a produção e qualidade dos bezerros / Mais Precoce Embrapa Project: increase of the production and quality of calves

O Projeto Mais Precoce é constituído por dois projetos executados por uma equipe de pesquisadores da Embrapa em parceria com outras instituições como Universidades e Associações. O primeiro projeto, denominado Mais Cria, é liderado pela Embrapa Pantanal, com objetivo de aumentar a produção e produtividade de bezerros, visto que a região é caracterizada como “matrizeiro” (produção de bezerros que serão vendidos para o Planalto). O segundo projeto, denominado Mais Engorda, é liderado pela Embrapa Gado de Corte, com objetivo de receber os bezerros de diferentes sistemas, inclusive do Pantanal, e levá-los até a terminação, comparando sistemas e custos de produção. Executado desde 2014 pelos pesquisadores, a proposta busca alinhar-se aos problemas enfrentados pela cadeia do novilho precoce, um programa estadual Precoce MS, que serve de incentivo à produção no novilho precoce. Os produtores aprovados no programa recebem isenção do Imposto Sobre Circulação de Mercadorias e Serviços (ICMS) de 16% a 67% do valor total pago sobre os animais. As bonificações são concedidas com base em critérios que avaliam fatores como o processo produtivo e a tipificação da carcaça. Por isso reproduzir/produzir animais bem avaliados é o começo para o produtor rural poder se inscrever no programa de incentivo fiscal, além de ter que atender a critérios como estar com as obrigações fiscais, tributárias, sanitárias, trabalhistas da fazenda regularizadas e possuir um responsável técnico pela propriedade. O foco desta revisão será o projeto Mais Cria, visto que o mesmo contempla vários experimentos de reprodução animal.(AU)

Mais Precoce consists of two projects executed by Embrapa researchers in partnership with other institutions, such as Universities, and Associations. The first project, denominated Mais Cria, is conducted by Embrapa Pantanal, with the objective of increasing the production and productivity of calves, because the region is characterized as "matrizeiro" (production of calves). The second project, denominated Mais Engorda, is conduct by Embrapa Gado de Corte, to receive calves from different systems, including the Pantanal, and bring them to completion, comparing systems and production costs. Executed since 2014, the proposal seeks to align itself with the problems faced by the precocious steer chain, a state program MS Precoce, which serves as an incentive to the production in the precocious steer. Producers approved in the program receive exemption from the Tax on Circulation of Services and Goods (ICMS) from 16% to 67% of the total value paid on the animals. Bonuses are granted based on criteria that assess factors such as the production process and the carcass typing. So reproducing / producing well-evaluated animals is the beginning for the rural producer to be able to enroll in the fiscal incentive program, in addition to having to meet criteria such as being taxed, tax, sanitary, farm labor regularized and have a technician responsible property. The focus of this review will be Mais Cria project, since it contemplates several experiments of animal reproduction.(AU)

Projeto Mais Precoce Embrapa: aumentar a produção e qualidade dos bezerros / Mais Precoce Embrapa Project: increase of the production and quality of calves

O Projeto Mais Precoce é constituído por dois projetos executados por uma equipe de pesquisadores da Embrapa em parceria com outras instituições como Universidades e Associações. O primeiro projeto, denominado Mais Cria, é liderado pela Embrapa Pantanal, com objetivo de aumentar a produção e produtividade de bezerros, visto que a região é caracterizada como “matrizeiro” (produção de bezerros que serão vendidos para o Planalto). O segundo projeto, denominado Mais Engorda, é liderado pela Embrapa Gado de Corte, com objetivo de receber os bezerros de diferentes sistemas, inclusive do Pantanal, e levá-los até a terminação, comparando sistemas e custos de produção. Executado desde 2014 pelos pesquisadores, a proposta busca alinhar-se aos problemas enfrentados pela cadeia do novilho precoce, um programa estadual Precoce MS, que serve de incentivo à produção no novilho precoce. Os produtores aprovados no programa recebem isenção do Imposto Sobre Circulação de Mercadorias e Serviços (ICMS) de 16% a 67% do valor total pago sobre os animais. As bonificações são concedidas com base em critérios que avaliam fatores como o processo produtivo e a tipificação da carcaça. Por isso reproduzir/produzir animais bem avaliados é o começo para o produtor rural poder se inscrever no programa de incentivo fiscal, além de ter que atender a critérios como estar com as obrigações fiscais, tributárias, sanitárias, trabalhistas da fazenda regularizadas e possuir um responsável técnico pela propriedade. O foco desta revisão será o projeto Mais Cria, visto que o mesmo contempla vários experimentos de reprodução animal.

Mais Precoce consists of two projects executed by Embrapa researchers in partnership with other institutions, such as Universities, and Associations. The first project, denominated Mais Cria, is conducted by Embrapa Pantanal, with the objective of increasing the production and productivity of calves, because the region is characterized as "matrizeiro" (production of calves). The second project, denominated Mais Engorda, is conduct by Embrapa Gado de Corte, to receive calves from different systems, including the Pantanal, and bring them to completion, comparing systems and production costs. Executed since 2014, the proposal seeks to align itself with the problems faced by the precocious steer chain, a state program MS Precoce, which serves as an incentive to the production in the precocious steer. Producers approved in the program receive exemption from the Tax on Circulation of Services and Goods (ICMS) from 16% to 67% of the total value paid on the animals. Bonuses are granted based on criteria that assess factors such as the production process and the carcass typing. So reproducing / producing well-evaluated animals is the beginning for the rural producer to be able to enroll in the fiscal incentive program, in addition to having to meet criteria such as being taxed, tax, sanitary, farm labor regularized and have a technician responsible property. The focus of this review will be Mais Cria project, since it contemplates several experiments of animal reproduction.

Changes in morphology and viability on the development of bovine embryos in vitro fertilized with experimentally contaminated semen to Escherichia coli Shiga toxin producing stx2 / Alterações na morfologia e na viabilidade no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina Shiga stx2

The objective of this study was to evaluate by optical microscopy and transmission electron, changes in morphology and viability of the development of bovine embryos, fertilized with semen experimentally contaminated (STEC). Oocytes were aspirated from ovaries of slaughtered cows and the intact zona pellucida were selected and matured. After 20-24 hours of maturation, the oocytes were divided into 2 groups. The first, control group (n = 418),fertilized with semen tested and without any type of contaminant and the second, the infected group (n =  415), fertilized with sperm exposed to STEC. Both semen were treated by the technique of discontinuous Percoll gradient. After the period of fertilization, embryos were evaluated for their morphology and viability by optical and electron microscopy. In  morphologic evaluation, the oocytes fertilized with contaminated semen showed cytoplasmic shrinkage, gaps in the division, asymmetry of blastomeres, ooplasm grainy, dark brown color, vacuoles formation, degeneration and zona pellucid disruption. These changes were not observed in the control group. The cleavage rate was 70.3 and 52.8%, respectively, for control and infected groups, significant differences (p = 0.0001). After the 5th day of embryonic development, where it was observed 44.7% of morula in the control group, and 22.4% in the contaminated group, showing a significant difference (p = 0.0001). The presence of STEC interferes with the cleavage rate of embryos and also prevents and causes a decline in embryonic development to the morula stage and cause morphological changes during this development.(AU)

O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de microscopia óptica e eletrônica de transmissão, as alterações na morfologia e a viabilidade do desenvolvimento de embriões bovinos fecundados com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina shiga stx2 (STEC). Para tanto, oócitos foram aspirados de ovários de vacas abatidas e selecionados para maturação in vitro. Após 20-24 horas de maturação, os oócitos foram divididos em 2 grupos. Sendo o primeiro grupo o controle (n = 418), fertilizado com sêmen testado e sem nenhum tipo de contaminante e o segundo, o grupo contaminado (n = 415), fertilizado com sêmen exposto a STEC. Cada sêmen foi tratado pela técnica de gradiente descontínuo de Percoll. Após o período de fecundação, os embriões foram avaliados quanto a sua morfologia e viabilidade, com o auxílio da microscopia óptica e eletrônica. Na avaliação morfológica, os oócitos fecundados com o sêmen contaminado apresentaram retração citoplasmática, falhas na divisão, assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, coloração castanho-escuro, formação de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida. Essas alterações não foram observadas no grupo controle. A avaliação de todos oócitos incluídos mostrou taxas de clivagem de 70,3 e 52,8%, respectivamente, para embriões controle e contaminado (p = 0,0001). Após o 5º dia de desenvolvimento embrionário foram observadas 44,7% de mórulas no grupo controle e 22,4% no grupo contaminado, apresen tando diferença significativa (p=0,0001). A presença da STEC interfere na taxa de clivagem dos embriões e também inviabiliza e provoca queda no desenvolvimento embrionário ao estádio de mórula, além de causar alterações morfológicas durante esse desenvolvimento.(AU)

Alterações na morfologia e na viabilidade no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina Shiga stx2

ABSTRACT:The objective of this study was to evaluate by optical microscopy and transmission electron, changes in morphology and viability of the development of bovine embryos, fertilized with semen experimentally contaminated (STEC). Oocytes were aspirated from ovaries of slaughtered cows and the intact zona pellucida were selected and matured. After 20-24 hours of maturation, the oocytes were divided into 2 groups. The first, control group (n = 4l8),fertilized with semen tested and without any type of contaminant and the second, the infected group (n = 415), fertilized with sperm exposed to STEC. Both semen were treated by the technique of discontinuous Percoll gradient. After the period of fertilization, embryos were evaluated for their morphology and viability by optical and electron microscopy. In morphologic evaluation, the oocytes fertilized with contaminated semen showed cytoplasmic shrinkage, gaps in the division, asymmetry of blastomeres, ooplasm grainy, dark brown color, vacuoles formation, degeneration and zona pellucid disruption. These changes were not observed in the control group. The cleavage rate was 70.3 and 52.8%, respectively, for control and infected groups, significant differences (p = 0.0001). After the 5th day of embryonic development, where it was observed 44.7% of morula in the control group, and 22.4% in the contaminated group, showing a significant difference (p = 0.0001). The presence of STEC interferes with the cleavage rate of embryos and also prevents and causes a decline in embryonic development to the morula stage and cause morphological changes during this development.

RESUMO:O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de micros- copia óptica e eletrônica de transmissão, as alterações na morfologia e a viabilidade do desenvolvimento de embriões bovinos fecundados com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina shiga stx2 (STEC). Para tanto, oócitos foram aspirados de ovários de vacas abatidas e selecionados para maturação in vitro. Após 20-24 horas de maturação, os oócitos foram divididos em 2 grupos. Sendo o primeiro grupo o controle (n = 418), fertilizado com sêmen testado e sem nenhum tipo de contaminante e o segundo, o grupo contaminado (n = 415), fertilizado com sêmen exposto a STEC. Cada sêmen foi tra tado pela técnica de gradiente descontínuo de Percoll. Após o período de fecundação, os embriões foram avaliados quanto a sua morfologia e viabilidade, com o auxílio da microscopia óptica e eletrônica. Na ava liação morfológica, os oócitos fecundados com o sêmen contaminado apresentaram retração citoplasmática, falhas na divisão, assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, coloração castanho-escuro, formação de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida. Essas alte rações não foram observadas no grupo controle. A avaliação de todos oócitos incluídos mostrou taxas de clivagem de 70,3 e 52,8%, respec tivamente, para embriões controle e contaminado (p = 0,0001). Após o 5° dia de desenvolvimento embrionário foram observadas 44,7% de mórulas no grupo controle e 22,4% no grupo contaminado, apresen tando diferença significativa (p=0,0001). A presença da STEC interfere na taxa de clivagem dos embriões e também inviabiliza e provoca queda no desenvolvimento embrionário ao estádio de mórula, além de causar alterações morfológicas durante esse desenvolvimento.

Alterações na morfologia e na viabilidade no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina Shiga stx2 / Changes in morphology and viability on the development of bovine embryos in vitro fertilized with experimentally contaminated semen to Escherichia coli Shiga toxin producing stx2

O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de microscopia óptica e eletrônica de transmissão, as alterações na morfologia e a viabilidade do desenvolvimento de embriões bovinos fecundados com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina shiga stx2 (STEC). Para tanto, oócitos foram aspirados de ovários de vacas abatidas e selecionados para maturação in vitro. Após 20-24 horas de maturação, os oócitos foram divididos em 2 grupos. Sendo o primeiro grupo o controle (n = 418), fertilizado com sêmen testado e sem nenhum tipo de contaminante e o segundo, o grupo contaminado (n = 415), fertilizado com sêmen exposto a STEC. Cada sêmen foi tratado pela técnica de gradiente descontínuo de Percoll. Após o período de fecundação, os embriões foram avaliados quanto a sua morfologia e viabilidade, com o auxílio da microscopia óptica e eletrônica. Na ava liação morfológica, os oócitos fecundados com o sêmen contaminado apresentaram retração citoplasmática, falhas na divisão, assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, coloração castanho-escuro, formação de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida. Essas alterações não foram observadas no grupo controle. A avaliação de todos oócitos incluídos mostrou taxas de clivagem de 70,3 e 52,8%, respectivamente, para embriões controle e contaminado (p = 0,0001). Após o 5° dia de desenvolvimento embrionário foram observadas 44,7% de mórulas no grupo controle e 22,4% no grupo contaminado, apresentando diferença significativa (p=0,0001). A presença da STEC interfere na taxa de clivagem dos embriões e também inviabiliza e provoca queda no desenvolvimento embrionário ao estádio de mórula, além de causar alterações morfológicas durante esse desenvolvimento.(AU)

The objective of this study was to evaluate by optical microscopy and transmission electron, changes in morphology and viability of the development of bovine embryos, fertilized with semen experimentally contaminated (STEC). Oocytes were aspirated from ovaries of slaughtered cows and the intact zona pellucida were selected and matured. After 20-24 hours of maturation, the oocytes were divided into 2 groups. The first, control group (n = 4l8),fertilized with semen tested and without any type of contaminant and the second, the infected group (n = 415), fertilized with sperm exposed to STEC. Both semen were treated by the technique of discontinuous Percoll gradient. After the period of fertilization, embryos were evaluated for their morphology and viability by optical and electron microscopy. In morphologic evaluation, the oocytes fertilized with contaminated semen showed cytoplasmic shrinkage, gaps in the division, asymmetry of blastomeres, ooplasm grainy, dark brown color, vacuoles formation, degeneration and zona pellucid disruption. These changes were not observed in the control group. The cleavage rate was 70.3 and 52.8%, respectively, for control and infected groups, significant differences (p = 0.0001). After the 5th day of embryonic development, where it was observed 44.7% of morula in the control group, and 22.4% in the contaminated group, showing a significant difference (p = 0.0001). The presence of STEC interferes with the cleavage rate of embryos and also prevents and causes a decline in embryonic development to the morula stage and cause morphological changes during this development.(AU)

Changes in morphology and viability on the development of bovine embryos in vitro fertilized with experimentally contaminated semen to Escherichia coli Shiga toxin producing stx2 / Alterações na morfologia e na viabilidade no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina Shiga stx2

The objective of this study was to evaluate by optical microscopy and transmission electron, changes in morphology and viability of the development of bovine embryos, fertilized with semen experimentally contaminated (STEC). Oocytes were aspirated from ovaries of slaughtered cows and the intact zona pellucida were selected and matured. After 20-24 hours of maturation, the oocytes were divided into 2 groups. The first, control group (n = 418),fertilized with semen tested and without any type of contaminant and the second, the infected group (n =  415), fertilized with sperm exposed to STEC. Both semen were treated by the technique of discontinuous Percoll gradient. After the period of fertilization, embryos were evaluated for their morphology and viability by optical and electron microscopy. In  morphologic evaluation, the oocytes fertilized with contaminated semen showed cytoplasmic shrinkage, gaps in the division, asymmetry of blastomeres, ooplasm grainy, dark brown color, vacuoles formation, degeneration and zona pellucid disruption. These changes were not observed in the control group. The cleavage rate was 70.3 and 52.8%, respectively, for control and infected groups, significant differences (p = 0.0001). After the 5th day of embryonic development, where it was observed 44.7% of morula in the control group, and 22.4% in the contaminated group, showing a significant difference (p = 0.0001). The presence of STEC interferes with the cleavage rate of embryos and also prevents and causes a decline in embryonic development to the morula stage and cause morphological changes during this development.

O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de microscopia óptica e eletrônica de transmissão, as alterações na morfologia e a viabilidade do desenvolvimento de embriões bovinos fecundados com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina shiga stx2 (STEC). Para tanto, oócitos foram aspirados de ovários de vacas abatidas e selecionados para maturação in vitro. Após 20-24 horas de maturação, os oócitos foram divididos em 2 grupos. Sendo o primeiro grupo o controle (n = 418), fertilizado com sêmen testado e sem nenhum tipo de contaminante e o segundo, o grupo contaminado (n = 415), fertilizado com sêmen exposto a STEC. Cada sêmen foi tratado pela técnica de gradiente descontínuo de Percoll. Após o período de fecundação, os embriões foram avaliados quanto a sua morfologia e viabilidade, com o auxílio da microscopia óptica e eletrônica. Na avaliação morfológica, os oócitos fecundados com o sêmen contaminado apresentaram retração citoplasmática, falhas na divisão, assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, coloração castanho-escuro, formação de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida. Essas alterações não foram observadas no grupo controle. A avaliação de todos oócitos incluídos mostrou taxas de clivagem de 70,3 e 52,8%, respectivamente, para embriões controle e contaminado (p = 0,0001). Após o 5º dia de desenvolvimento embrionário foram observadas 44,7% de mórulas no grupo controle e 22,4% no grupo contaminado, apresen tando diferença significativa (p=0,0001). A presença da STEC interfere na taxa de clivagem dos embriões e também inviabiliza e provoca queda no desenvolvimento embrionário ao estádio de mórula, além de causar alterações morfológicas durante esse desenvolvimento.

Alterações na morfologia e na viabilidade no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina Shiga stx2

ABSTRACT:The objective of this study was to evaluate by optical microscopy and transmission electron, changes in morphology and viability of the development of bovine embryos, fertilized with semen experimentally contaminated (STEC). Oocytes were aspirated from ovaries of slaughtered cows and the intact zona pellucida were selected and matured. After 20-24 hours of maturation, the oocytes were divided into 2 groups. The first, control group (n = 4l8),fertilized with semen tested and without any type of contaminant and the second, the infected group (n = 415), fertilized with sperm exposed to STEC. Both semen were treated by the technique of discontinuous Percoll gradient. After the period of fertilization, embryos were evaluated for their morphology and viability by optical and electron microscopy. In morphologic evaluation, the oocytes fertilized with contaminated semen showed cytoplasmic shrinkage, gaps in the division, asymmetry of blastomeres, ooplasm grainy, dark brown color, vacuoles formation, degeneration and zona pellucid disruption. These changes were not observed in the control group. The cleavage rate was 70.3 and 52.8%, respectively, for control and infected groups, significant differences (p = 0.0001). After the 5th day of embryonic development, where it was observed 44.7% of morula in the control group, and 22.4% in the contaminated group, showing a significant difference (p = 0.0001). The presence of STEC interferes with the cleavage rate of embryos and also prevents and causes a decline in embryonic development to the morula stage and cause morphological changes during this development.

RESUMO:O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de micros- copia óptica e eletrônica de transmissão, as alterações na morfologia e a viabilidade do desenvolvimento de embriões bovinos fecundados com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina shiga stx2 (STEC). Para tanto, oócitos foram aspirados de ovários de vacas abatidas e selecionados para maturação in vitro. Após 20-24 horas de maturação, os oócitos foram divididos em 2 grupos. Sendo o primeiro grupo o controle (n = 418), fertilizado com sêmen testado e sem nenhum tipo de contaminante e o segundo, o grupo contaminado (n = 415), fertilizado com sêmen exposto a STEC. Cada sêmen foi tra tado pela técnica de gradiente descontínuo de Percoll. Após o período de fecundação, os embriões foram avaliados quanto a sua morfologia e viabilidade, com o auxílio da microscopia óptica e eletrônica. Na ava liação morfológica, os oócitos fecundados com o sêmen contaminado apresentaram retração citoplasmática, falhas na divisão, assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, coloração castanho-escuro, formação de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida. Essas alte rações não foram observadas no grupo controle. A avaliação de todos oócitos incluídos mostrou taxas de clivagem de 70,3 e 52,8%, respec tivamente, para embriões controle e contaminado (p = 0,0001). Após o 5° dia de desenvolvimento embrionário foram observadas 44,7% de mórulas no grupo controle e 22,4% no grupo contaminado, apresen tando diferença significativa (p=0,0001). A presença da STEC interfere na taxa de clivagem dos embriões e também inviabiliza e provoca queda no desenvolvimento embrionário ao estádio de mórula, além de causar alterações morfológicas durante esse desenvolvimento.

PCR fluorescente associada à eletroforese capilar como ferramenta de diagnóstico de bactérias no sêmen / Fluorescent PCR associated with capillary electrophoresis as a diagnostic tool of bacteria in semen

Este estudo avaliou o limiar de detecção da técnica de PCR aliada à eletroforese capilar para diagnóstico da Brucella abortus em sêmen bovino. Doses inseminantes livres de patógenos foram contaminadas experimentalmente com B. abortus em escalas que variavam de 10(0) a 10(7) bactérias/mL e submetidas à extração de DNA pelo método de fenol/clorofórmio. A amplificação por PCR foi realizada utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores, previamente descritos na literatura, BF-5'gcgctcaggctgccgacgcaa3' (cromóforo FAM) e BR-5'accagccattgcggtcggta3' para B. abortus.) Os pares de oligonucleotídeos geraram fragmentos de 193 pb. Após PCR, a visualização dos fragmentos foi realizada em gel de acrilamida 8% corada pela prata e por eletroforese capilar fluorescente em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA. A detecção de DNA de B. abortus em sêmen bovino através de eletroforese capilar fluorescente foi possível a partir de concentração de 10(3) bactérias/mL, enquanto que em gel de poliacrilamida 8% o limite de detecção foi de 10(5) bactérias/mL. A eletroforese capilar demonstrou ser uma alternativa rápida, eficaz e de alta sensibilidade na detecção de DNA de Brucella em sêmen bovino, podendo ser uma valiosa ferramenta para a avaliação da sanidade do rebanho e para o controle de qualidade do sêmen produzido em centrais de inseminação artificial.(AU)

This study was performed in order to evaluate the detection limit of PCR with fluorescent capillary electrophoresis for Brucella abortus diagnosis in bovine semen. Negative bovine semen samples were artificially contaminated with B. abortus (10(0) to 10(7) bacteria/mL) and DNA was extracted by phenol/chloroform protocol. DNA was amplified by PCR with oligonucleotides previously described BF-5'gcgctcaggctgccgacgcaa3' (6-FAM labeled) and BR-5'accagccattgcggtcggta3' for B. abortus. Oligonucleotides generated DNA fragments of 193 bp. DNA fragments visualization was done under UV light at silver stained 8% poliacrylamide gel, and fluorescent capillary electrophoresis performed in an automatic DNA fragment analyzer. The detection limit of capillary electrophoresis for B. abortus was 10(3) bacteria/mL, while for silver stained 8% poliacrylamide gel it was 10(5) bacteria/mL. PCR with fluorescent capillary electrophoresis is fast, efficient and highly sensitive test for DNA detection of Brucella in bovine semen, and itcan be an important tool for health evaluation of the herd and semen sanitary control in artificial insemination centers.(AU)

PCR fluorescente associada à eletroforese capilar como ferramenta de diagnóstico de bactérias no sêmen / Fluorescent PCR associated with capillary electrophoresis as a diagnostic tool of bacteria in semen

Este estudo avaliou o limiar de detecção da técnica de PCR aliada à eletroforese capilar para diagnóstico da Brucella abortus em sêmen bovino. Doses inseminantes livres de patógenos foram contaminadas experimentalmente com B. abortus em escalas que variavam de 10(0) a 10(7) bactérias/mL e submetidas à extração de DNA pelo método de fenol/clorofórmio. A amplificação por PCR foi realizada utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores, previamente descritos na literatura, BF-5'gcgctcaggctgccgacgcaa3' (cromóforo FAM) e BR-5'accagccattgcggtcggta3' para B. abortus.) Os pares de oligonucleotídeos geraram fragmentos de 193 pb. Após PCR, a visualização dos fragmentos foi realizada em gel de acrilamida 8% corada pela prata e por eletroforese capilar fluorescente em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA. A detecção de DNA de B. abortus em sêmen bovino através de eletroforese capilar fluorescente foi possível a partir de concentração de 10(3) bactérias/mL, enquanto que em gel de poliacrilamida 8% o limite de detecção foi de 10(5) bactérias/mL. A eletroforese capilar demonstrou ser uma alternativa rápida, eficaz e de alta sensibilidade na detecção de DNA de Brucella em sêmen bovino, podendo ser uma valiosa ferramenta para a avaliação da sanidade do rebanho e para o controle de qualidade do sêmen produzido em centrais de inseminação artificial.

This study was performed in order to evaluate the detection limit of PCR with fluorescent capillary electrophoresis for Brucella abortus diagnosis in bovine semen. Negative bovine semen samples were artificially contaminated with B. abortus (10(0) to 10(7) bacteria/mL) and DNA was extracted by phenol/chloroform protocol. DNA was amplified by PCR with oligonucleotides previously described BF-5'gcgctcaggctgccgacgcaa3' (6-FAM labeled) and BR-5'accagccattgcggtcggta3' for B. abortus. Oligonucleotides generated DNA fragments of 193 bp. DNA fragments visualization was done under UV light at silver stained 8% poliacrylamide gel, and fluorescent capillary electrophoresis performed in an automatic DNA fragment analyzer. The detection limit of capillary electrophoresis for B. abortus was 10(3) bacteria/mL, while for silver stained 8% poliacrylamide gel it was 10(5) bacteria/mL. PCR with fluorescent capillary electrophoresis is fast, efficient and highly sensitive test for DNA detection of Brucella in bovine semen, and itcan be an important tool for health evaluation of the herd and semen sanitary control in artificial insemination centers.

Proteínas do plasma seminal relacionadas a congelabilidade do sêmen bovino / Seminal plasma proteins related to bovine semen freezabilty

A tecnologia da criopreservação tem apresentado desenvolvimento notório, tanto no melhoramento da qualidade como na fertilidade do sêmen após o processamento. Apesar dos progressos alcançados com as técnicas da criopreservação do sêmen, ainda são obtidas perdas em torno de 50% de espermatozóides viáveis durante o processo (Watson, 2000). Os indivíduos podem ser classificados como produtores de sêmen de alta e baixa congelabilidade, dependendo das características estruturais da membrana, o que é geneticamente determinado, predispondo à sobrevivência ao estresse da criopreservação (WATSON, 2000). Várias proteínas do plasma seminal bovino têm influência na congelabilidade do sêmen. Roncoletta (1999), através da análise das proteínas do plasma seminal, verificaram três polipepteptídeos (45, 24 e 10,8 kDa) com densidade óptica superior nas amostras de reprodutores de melhor congelabilidade do sêmen. Outras proteínas também foram relacionadas à alta congelabilidade do sêmen: a proteína ácida do fluído seminal bovino (aSFP), a clusterina, a albumina e a osteopontina (OPN); podendo assim, ser indicadas como marcadores. Também foram indicadas mais duas bandas protéicas (15-16 kDa, pI 4,7-5,2 e relacionadas à alta congelabilidade do sêmen, porém que não foram identificadas no estudo, mas que pelo peso molecular e ponto isoelétrico aproximado poderiam corresponder às proteínas BSP A1/A2 (15-16 kDa, pI 4,7-5,2) ou BSP A3 (13-14 kDa, pI 6,0-6,5) (JOBIM et al., 2004). Outros estudos indicam ainda as proteínas P25b e as proteínas anticongelação (AFPs), como proteínas relacionadas a congelabilidade do sêmen. Apesar dos progressos no conhecimento das proteínas relacionadas à criopreservação, ainda encontramos resultados bastante contraditórios e por vezes, a ausência do conhecimento da forma de proteção conferida por determinadas proteínas... (AU)

Cryopreservation techniques has shown remarkable development, both in improving the quality and the fertility of semen after processing. Despite these progress , losses are around 50% of viable sperm during the process (Watson, 2000). Individuals can be classified as producers of high-and low semen The structural characteristics of the membrane, which is genetically determined, predisposes the survival of the stress of cryopreservation (Watson, 2000). Several proteins of bovine seminal plasma influence on semen freezability . Roncoletta (1999), analysing seminal plasma proteins, find three polipepteptídeos (45, 24 and 10.8 kDa) with higher optical density in samples of the bulls with high freezability semen. Other proteins were also highly related to the frozen semen: the acid bovine seminal fluid (aSFP), the clusterin, the albumin and osteopontin (OPN) can be shown as semen freezability markers. Also two protein bands, (15-16 kDa, pI 4,7-5,2) are related to the high semen freezability, based in molecular weight and isoelectric point could correspond to the protein BSP A1/A2 (15-16 kDa, pI 4,7-5,2) or BSP A3 (13-14 kDa, pI 6,0-6,5) (JOBIM, et al 2004). Other studies also indicate the proteins P25b as antifreezeprotein (AFPs) related to semen freezability... (AU)

Metodologia de avaliação laboratorial do sêmen congelado bovino / Methods of assessments of frozen-thawed bull semen

Diversos métodos de análise laboratorial do sêmen congelado bovino têm sido desenvolvidos, no entanto a correlação entre os parâmetros espermáticos e os índices de fertilidade in vivo ainda são variáveis. Dentre os principais testes de análise espermática utilizados, pode-se destacar: análise subjetiva da motilidade, análise computadorizada do movimento espermático e morfologia, testes de separação, análise morfofuncional por meio de microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo. Embora nenhuma técnica de avaliação tomada isoladamente apresente sensibilidade suficiente para a determinação da fertilidade, a combinação dos diversos métodos tem agregado maior precisão para a estimativa do potencial de fertilização das amostras de sêmen bovino congelado. Objetivou-se com esta revisão descrever os métodos de análise laboratorial do sêmen bovino congelado.(AU)

Several methods of laboratory analysis of frozen bovine semen have been developed, however the correlation between sperm parameters and fertility rates in vivo are still variable. Among the major sperm analysis we can found: sperm motion and morphology, separation tests and morphofunctional analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Although no evaluation technique taken alone provide enough sensitivity for the fertility determination, the combination of many methods has added greater precision to estimate the potential fertility of frozen bovine semen samples. The objective of this review will be describe the methods of laboratory analysis of frozen bovine semen.(AU)

Metodologia de avaliação laboratorial do sêmen congelado bovino / Methods of assessments of frozen-thawed bull semen

Diversos métodos de análise laboratorial do sêmen congelado bovino têm sido desenvolvidos, no entanto a correlação entre os parâmetros espermáticos e os índices de fertilidade in vivo ainda são variáveis. Dentre os principais testes de análise espermática utilizados, pode-se destacar: análise subjetiva da motilidade, análise computadorizada do movimento espermático e morfologia, testes de separação, análise morfofuncional por meio de microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo. Embora nenhuma técnica de avaliação tomada isoladamente apresente sensibilidade suficiente para a determinação da fertilidade, a combinação dos diversos métodos tem agregado maior precisão para a estimativa do potencial de fertilização das amostras de sêmen bovino congelado. Objetivou-se com esta revisão descrever os métodos de análise laboratorial do sêmen bovino congelado.

Several methods of laboratory analysis of frozen bovine semen have been developed, however the correlation between sperm parameters and fertility rates in vivo are still variable. Among the major sperm analysis we can found: sperm motion and morphology, separation tests and morphofunctional analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Although no evaluation technique taken alone provide enough sensitivity for the fertility determination, the combination of many methods has added greater precision to estimate the potential fertility of frozen bovine semen samples. The objective of this review will be describe the methods of laboratory analysis of frozen bovine semen.

Proteínas do plasma seminal relacionadas a congelabilidade do sêmen bovino / Seminal plasma proteins related to bovine semen freezabilty

A tecnologia da criopreservação tem apresentado desenvolvimento notório, tanto no melhoramento da qualidade como na fertilidade do sêmen após o processamento. Apesar dos progressos alcançados com as técnicas da criopreservação do sêmen, ainda são obtidas perdas em torno de 50% de espermatozóides viáveis durante o processo (Watson, 2000). Os indivíduos podem ser classificados como produtores de sêmen de alta e baixa congelabilidade, dependendo das características estruturais da membrana, o que é geneticamente determinado, predispondo à sobrevivência ao estresse da criopreservação (WATSON, 2000). Várias proteínas do plasma seminal bovino têm influência na congelabilidade do sêmen. Roncoletta (1999), através da análise das proteínas do plasma seminal, verificaram três polipepteptídeos (45, 24 e 10,8 kDa) com densidade óptica superior nas amostras de reprodutores de melhor congelabilidade do sêmen. Outras proteínas também foram relacionadas à alta congelabilidade do sêmen: a proteína ácida do fluído seminal bovino (aSFP), a clusterina, a albumina e a osteopontina (OPN); podendo assim, ser indicadas como marcadores. Também foram indicadas mais duas bandas protéicas (15-16 kDa, pI 4,7-5,2 e relacionadas à alta congelabilidade do sêmen, porém que não foram identificadas no estudo, mas que pelo peso molecular e ponto isoelétrico aproximado poderiam corresponder às proteínas BSP A1/A2 (15-16 kDa, pI 4,7-5,2) ou BSP A3 (13-14 kDa, pI 6,0-6,5) (JOBIM et al., 2004). Outros estudos indicam ainda as proteínas P25b e as proteínas anticongelação (AFPs), como proteínas relacionadas a congelabilidade do sêmen. Apesar dos progressos no conhecimento das proteínas relacionadas à criopreservação, ainda encontramos resultados bastante contraditórios e por vezes, a ausência do conhecimento da forma de proteção conferida por determinadas proteínas...

Cryopreservation techniques has shown remarkable development, both in improving the quality and the fertility of semen after processing. Despite these progress , losses are around 50% of viable sperm during the process (Watson, 2000). Individuals can be classified as producers of high-and low semen The structural characteristics of the membrane, which is genetically determined, predisposes the survival of the stress of cryopreservation (Watson, 2000). Several proteins of bovine seminal plasma influence on semen freezability . Roncoletta (1999), analysing seminal plasma proteins, find three polipepteptídeos (45, 24 and 10.8 kDa) with higher optical density in samples of the bulls with high freezability semen. Other proteins were also highly related to the frozen semen: the acid bovine seminal fluid (aSFP), the clusterin, the albumin and osteopontin (OPN) can be shown as semen freezability markers. Also two protein bands, (15-16 kDa, pI 4,7-5,2) are related to the high semen freezability, based in molecular weight and isoelectric point could correspond to the protein BSP A1/A2 (15-16 kDa, pI 4,7-5,2) or BSP A3 (13-14 kDa, pI 6,0-6,5) (JOBIM, et al 2004). Other studies also indicate the proteins P25b as antifreezeprotein (AFPs) related to semen freezability...