RESUMO
The phospholipases D (PLDs) of the venom of the spider Loxosceles gaucho are the main toxins responsible for the observed effects in the poisoning. These toxins can exert a high hydrolytic activity on sphingomyelins, releasing ceramide 1-phosphate (C1P) and cyclic phosphates (cPA). cPA affects numerous cellular functions, including inhibition of tumor cell invasion and metastasis. This feature could be interesting for biotechnological use, however, PLDs promote strong platelet aggregation. On the other hand, the disintegrins present in Viperidae venom venoms can inhibit platelet aggregation and can bind to tumor cells because of their ability to interact with the highly expressed integrins (αvβ3) in these cells. Thus, a fusion of a snake disintegrin with a spider PLD may be an interesting option to eliminate unwanted platelet aggregation caused by PLD, and further act as a toxin carrier for tumor cells. Thus, in order to exploit the antitumor potential of a L. gaucho PLD called LgRec1 and the particularity of an E. carinatus snake disintegrin called Echistatin to bind to tumor cells, we designed a hybrid toxin composed by the fusion of these two molecules which was called Rechistatin. This sequence was cloned into the pAE vector and transformed into BL21 (DE3) bacterium for protein expression, which was then purified by IMAC. Mass spectrometry and circular dichroism analyzed the molecular mass and secondary structure of the hybrid molecule, respectively. Platelet aggregation was measured by aggregometry assay. The cytotoxicity of Rechistatin was analyzed in tumor cells. The results showed that the hybrid molecule was cloned and successfully expressed in the soluble form. Rechistatin showed an expected band size of 38 kDa as confirmed by mass spectrometry. Circular dichroism revealed an expected pattern of conformation. Fusion of Echistatin to LgRec1 was effective to abolish the aggregation properties of LgRec1 PLD and ELISA tests on cells showed that Echistatin was efficient in directing LgRec1 to tumor cells U87-MG and RD. Additionally, the results showed that Rechistatin exerts cytotoxicity on U87-MG and RD cells. Taken together, these results indicate that the fusion of Echistatin with LgRec1 did not impair the biological activity of the chimeric toxin and was effective in abolishing the strong platelet aggregation of LgRec1. In addition, Echistatin was efficient in delivery LgRec1 to tumor cells, promoting cytotoxic activity.
As fosfolipases D (FLDs) do veneno da aranha Loxosceles gaucho são as principais toxinas responsáveis pelos efeitos observados no envenenamento. Estas toxinas podem exercer uma elevada atividade hidrolítica em esfingomielinas, liberando ceramida 1-fosfato (C1P) e fosfatos cíclicos (cPA). O cPA afeta numerosas funções celulares, incluindo a inibição da invasão de células tumorais e metástases. Esta caracteristica poderia ser interessante para utilização biotenológica, no entanto, FLDs promovem forte agregação plaquetária. Por outro lado, as disintegrinas presentes nos venenos de serpentes Viperidae são capazes de inibir a agregação plaquetária e podem se ligar às células tumorais devido à sua capacidade de interagir com as integrinas (αvβ3) altamente expressas nestas células. Assim, a fusão de uma disintegrina de serpente com uma FLD de aranha pode ser uma abordagem interessante para eliminar a agregação plaquetária indesejada provocada pela FLD, e ainda funcionar como uma carreadora desta toxina para células tumorais. Desta forma, visando explorar o potencial antitumoral de uma FLD de L. gaucho denominada LgRec1 e a particularidade de uma disintegrina de serpente E. carinatus denominada Echistatina de se ligar as células tumorais, realizamos a construção de uma toxina híbrida composta pela fusão dessas duas moléculas que foi denominada de Rechistatina. Esta sequência foi clonada no vector pAE e transformada em bactéria BL21 (DE3) para expressão proteica, que foi então purificada por IMAC. A massa molecular e a estrutura secundária da molécula híbrida foram analisadas por espectrometria de massas e dicroísmo circular, respectivamente. A agregação plaquetária foi medida por ensaio de agregometria, e a citotoxicidade da Rechistatina foi analisada em células tumorais. Os resultados mostraram que a molécula híbrida foi clonada e expressa com êxito na forma solúvel. A Rechistatina mostrou uma massa esperada de 38 kDa como confirmado por espectrometria de massa. O dicroísmo circular revelou um padrão de conformação esperado. A fusão de Echistatin a LgRec1 foi eficaz para abolir as propriedades de agregação da FLD LgRec1 e testes de ELISA em células mostraram que a Echistatina foi eficiente em direcionar a LgRec1 à celulas tumorais U87-MG e RD. Adicionalmente, os resultados mostraram que a Rechistatina exerce citotoxicidade nas células U87-MG e RD dose dependente. Em conjunto, estes resultados indicam que a fusão de Echistatina com LgRec1 não prejudicou a atividade biológica da toxina quimérica e foi eficaz para abolir a forte agregação plaquetária da LgRec1. Além disso, a Echistatina foi eficiente em direcionar a LgRec1 às células tumorias, promovendo atividade citotóxica.
RESUMO
Metalloproteinases from snake venoms are highly versatile enzymes, responsible for most of the symptoms of envenoming. Its action is related to the proteolysis of extracellular matrix components, activation or hydrolysis of components of the coagulation cascade and fibrinolysis, platelet aggregation inhibition, induction of local and systemic bleeding, pro-inflammatory activity, among others. This broad variety of biological activities is related to the structural diversity of this family of proteins. The SVMPs are divided into classes and subclasses of PI to PIII according to the organization of their domains. The SVMPs class PI are composed only by the catalytic domain, and in the class PIII, besides catalytic domain, SVMPs have disintegrin-like and cysteine-rich domains. The SVMPs class PII are composed of catalytic and disintegrin domain or only disintegrin that generally present the RGD tripeptide. For a better understanding of the structural and functional diversity of SVMPs, cDNAs from venom gland Bothrops neuwiedi encoding SVMPs were sequenced. SVMPs distinct from those described in venoms of other species were found. The BnMPIIx is a SVMP class PII showing a peculiar sequence with the fusion of a catalytic domain typical of procoagulant class P-III SVMPs with an RGDdisintegrin domain of SVMPs classP-II, with the inclusion of cysteines at positions undescribed previously. The aim of this work was to obtain of BnMPIIx and its disintegrin domain in recombinant form using vectors directing to the E. coli periplasm (pET20) or vectors that produce the recombinant protein in fusion with chaperones (pET32 and pSMT3). For this, the cDNAs encoding BnMPIIx and its disintegrin domain were amplified by PCR, digested with endonucleases BamHI and HindIII and cloned into pET20 vector. The disintegrin domain was also cloned into pET32 and pSMT3 vectors that express proteins with chaperones thioredoxin (Trx) and SUMO, respectively. The sequencing of the inserts did not show any mutations introduced during the cloning procedures. These vectors were transformed into the E. coli BL21 (DE3) or C43 (DE3) strains, and expression was evaluated at two temperatures (30°C and 37°C). To test platelet aggregation, human blood was collected in a 3,8% sodium citrate (1:9) from healthy donors. The mixture was centrifuged and the platelet-rich plasma (PRP) was submitted to an ADP-induced platelet aggregation assay. The analysis by SDS-PAGE showed that both BnMPIIx as its disintegrin domain were obtained by pET20 partially soluble in both temperatures (30°C and 37°C), resulting in inclusion bodies. Using the vectors pET32 and pSMT3 the disintegrin domain was expressed in a soluble form and was called Dis-Trx or Dis-SUMO respectively. However, the fusion proteins did not show biological activity. After cleavage of Trx it was not possible to isolate the disintegrin to validate the biological activity of Trx-Dis, but after cleavage of SUMO, the isolated disintegrin completely inhibited platelet aggregation in a concentration of approximately 2 µM. After several attempts using different expression vectors, we obtained a new recombinant disintegrin from Bothrops neuwiedi venom in pSMT3 vector, with preserved biological activity.This molecule may contribute to the study of hemostasis and cancer.
As metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs) são enzimas altamente versáteis, responsáveis por grande parte dos sintomas do envenenamento. Sua ação está relacionada com a proteólise dos componentes da matriz extracelular, ativação ou hidrólise de componentes da cascata de coagulação e fibrinólise, inibição da agregação plaquetária, indução de hemorragia local e sistêmica, atividade pró-inflamatória, entre outras. Essa ampla gama de atividades biológicas está relacionada com a diversidade estrutural dessa família de proteínas. As SVMPs são divididas em classes e subclasses de PI a PIII de acordo com a organização dos seus domínios. As SVMPs de classe PI são compostas apenas pelo domínio catalítico, já as PIII possuem domínio catalítico, tipo disintegrina e rico em cisteína. As SVMPs PII, possuí domínio catalítico e disintegrina ou apenas de disintegrina livre que geralmente apresenta o tripeptídeo RGD. Para melhor entender a diversidade estrutural e funcional das SVMPs, foram sequenciados cDNAs da glândula de veneno Bothrops neuwiedi que codificam SVMPs. Foram encontradas novas SVMPs, distintas das descritas em venenos de outras espécies. A BnMPIIx, uma SVMP de classe PII,apresentou uma sequência bastante peculiar com a fusão de um domínio catalítico similar ao de SVMPs pró-coagulantes da classe P-III com um domínio RGD-disintegrina, de SVMPs classe P-II, contendo cisteínas em posições não descritas anteriormente. O objetivo deste trabalho foi obter a BnMPIIx e seu domínio disintegrina na forma recombinante através de vetores de E. coli que direcionam para o periplasma (pET20) ou vetores que proporcionam a fusão com chaperonas (pET32 e pSMT3). Para isto, o cDNA da BnMPIIx e de seu dominínio disintegrina foram amplificados por PCR, digeridos com as endonucleases BamHI e HindIII e clonados em vetor pET20. O domínio disintegrina também foi clonado nos vetores pET32 e pSMT3 que expressam as proteínas com as chaperonas Tioredoxina (Trx) e SUMO, respectivamente. O sequenciamento de todos os insertos não apresentou mutações. Estes vetores foram transformados nas linhagens de E. coli BL21 (DE3) ou C43 (DE3) e a expressão avaliada em duas temperaturas (30ºC e 37ºC). Para o ensaio de inibição da agregação plaquetária, foi coletado sangue humano de doadores voluntários saudáveis em 3,8% de citrato de sódio (1:9). O sangue foi centrifugado e o plasma rico em plaquetas (PRP) submetido à agregação plaquetária induzida por ADP. A análise por SDS-PAGE mostrou que tanto a BnMPIIx quanto seu domínio disintegrina foram obtidos parcialmente solúveis em ambas as temperaturas (30ºC e 37ºC), gerando corpos de inclusão em vetor pET20. Já a disintegrina foi obtida com sucesso nos vetores pET32 e pSMT3 e foram denominadas Dis-Trx e Dis-SUMO respectivamente, no entanto não apresentaram atividade biológica. Após a clivagem da Trx, não foi possível isolar a disintegrina para validar a atividade biológica da Dis-Trx, já após a clivagem da SUMO a disintegrina inibiu completamente a agregação plaquetária em concentrações da ordem de 2 µM. Após diversas tentativas de clonagem usando diferentes vetores, nós obtivemos uma nova disintegrina recombinante de Bothrops neuwiedi em vetor pSMT3 com atividade biológica preservada, podendo esta molécula contribuir para os estudos de hemostasia e câncer.
