Efecto de la insulina humana sobre el crecimiento y expresión de proteínas celulares de Klebsiella pneumoniae aislada de pie diabético / Effect of human insulin on growth and cellular protein expression of Klebsiella pneumoniae isolated from diabetic foot infections

Algunos microorganismos patógenos aumentan su proliferación al cultivarlos en presencia de insulina, por lo tanto, la hiperinsulinemia podría influir sobre las infecciones de pacientes diabéticos. En este trabajo se determinó el efecto de la insulina sobre el crecimiento y expresión de proteínas celulares de Klebsiella pneumoniae aislada de pie diabético. Las bacterias se cultivaron en medio Luria-Bertani en presencia o en ausencia de insulina humana. El crecimiento se determinó midiendo la DO600 de los cultivos hasta alcanzar la fase estacionaria; se colectaron bacterias a diferentes tiempos para extraer sus proteínas celulares (extractos) y analizarlas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS y densitometría cuantitativa. En presencia de insulina (0,5 U/mL) el crecimiento bacteriano se incrementó en 40% respecto al control en las fases logarítmica temprana y media. Todos los perfiles electroforéticos de los extractos mostraron 27 bandas polipeptídicas (rango 150-9 kDa). La expresión del 41% de estas bandas aumentó en los extractos de las bacterias cultivadas con insulina, respecto a los controles, mientras que la expresión del 22% disminuyó. Los resultados indicaron que la insulina incrementó la proliferación y moduló la expresión genética de K. pneumoniae, sugiriendo que la hiperinsulinemia podría favorecer la severidad de infecciones en pacientes diabéticos.

Some pathogens increase their proliferation when cultured in the presence of insulin, therefore, hyperinsulinemia may influence diabetic infections. In this work we determine the effect of insulin on growth and cellular protein expression from Klebsiella pneumoniae isolated from diabetic foot infections. Bacteria were grown in Luria-Bertani medium in the presence and absence of human insulin. Growth was determined by measuring OD600 of the cultures until reached the stationary phase. In order to extract cellular proteins, bacteria were collected at different times to obtain extracts that were analyzed by electrophoresis on SDS-polyacrylamide gels and quantitative densitometry. In the presence of insulin (0.5 U/mL) bacterial growth increased by 40% compared with control in the early and middle logarithmic phase. All electrophoretic profiles of the extracts showed 27 polypeptide bands (range 150-9 kDa). The expression of 41% of these bands increased in extracts from bacteria grown with insulin when compared with controls, whereas protein expression decreased by 22%. The results indicated that insulin increased K. pneumoniae proliferation and modulated gene expression, suggesting that hyperinsulinemia could contribute to the severity of the infections in diabetic patients.

Traducción independiente de la estructura 5´cap del ARN genómico del virus dengue / 5´cap-independent translation of dengue virus genomic RNA

Objetivos. Analizar la participación de la caperuza metil-guanosín-trifosfato (5´cap) y de la región inicial del ARN genómico del virus dengue serotipo 2 (DENV-2) genotipo Americano en la traducción, utilizando un sistema libre de células obtenido de placenta humana. Materiales y métodos. Se preparó el plásmido recombinante pTZ18R-D2 conteniendo el ADN que codifica la 5´UTR y los primeros 201 nucleótidos de la cápside viral. Este plásmido se utilizó para transcribir el ARN correspondiente (ARN-D2), sin la 5´cap. El ARN-D2 fue traducido en un sistema constituido por la fracción posmitocondrial (S-30) de placenta humana y se evaluó la incorporación de [14C] aminoácidos en presencia del ARN-D2 y en su ausencia (control). Se diseñaron siete oligonucleótidos antisentido (OAs1-7) dirigidos contra secuencias de las estructuras SLA, SLB y cHP del ARN-D2 y se analizó el efecto de los mismos sobre la traducción ARN-D2. Resultados.El ARN-D2 produjo un incremento significativo (p<0,001) en la incorporación de [14C] aminoácidos, con estimulación del 75% de la actividad traduccional respecto al control. El análisis de los productos de traducción mostró un pico de incorporación correspondiente a péptidos con peso molecular aparente cercano al esperado (7,746 kDa). El OAs5, complementario a una secuencia de la estructura SLB del ARN-D2, inhibió completamente la traducción. Conclusiones. El ARN-D2 fue traducido de manera específica y eficiente, bajo condiciones semejantes a las intracelulares en humanos, por un mecanismo alternativo independiente de la 5´cap, que involucraría a la estructura SLB. Este mecanismo podría considerarse como blanco en el desarrollo de terapias antisentido para inhibir la reproducción del virus.

Objetives. To analyze the involvement of methyl guanosine triphosphate cap (5Æcap) and the start site of the genomic RNA of Dengue virus serotype 2 (DENV-2) American genotype in translation, using a cell-free system prepared from human placenta. Materials and methods. The recombinant plasmid pTZ18R-D2 was prepared containing DNA encoding the 5ÆUTR and the first 201 nucleotides of the viral capsid. This plasmid was used to transcribe the corresponding RNA (RNA-D2) without the 5Æ cap. The RNA-D2 was translated in a system consisting of the postmitochondrial fraction (S-30) from human placenta and the incorporation of [14C] aminoacids in the presence of RNA-D2 and in its absence (control) was evaluated. Seven antisenseoligonucleotides (OAs1-7) directed against sequences of the SLA, SLB and CHP structures of RNA-D2 were designed and the effect thereof on RNA-D2 translation was analyzed. Results.The RNA-D2 produced a significant increase (p<0.001) in the incorporation of [14C] amino acids, with 75% stimulation of translational activity compared to the control. Analysis of the translation products showed peak incorporation corresponding to peptides with apparent molecular weight close to the expected (7.746 kDa).The OAs5, complementary to a sequence of SLB structure of RNA-D2, completely inhibited translation. Conclusions. The RNA-D2 was translated specifically and efficiently under conditions similar to human intracellular conditions, by an alternative 5Æ cap-independent mechanism, which would involve the SLB structure. This mechanism might be seen as an aim in the development of antisense therapies to inhibit virus replication.

Efecto de la insulina en Saccharomyces cerevisiae: estimulación de la actividad enzimática de piruvato quinasa, expresión de proteínas citoplasmáticas y proliferación celular / Insulin effect in Saccharomyces cerevisiae: stimulation of pyruvate kinase activity, citoplasmatic proteins expression and cell proliferation

La levadura Saccharomyces cerevisiae es sensible a la insulina de mamíferos y actúa en el metabolismo de carbohidratos. Sin embargo, no hay estudios de su efecto en las enzimas glucolíticas de este microorganismo. Este trabajo demuestra que la insulina estimula la actividad de piruvato quinasa en S. cerevisiae durante su crecimiento en medio rico suplementado con glucosa y en condiciones aeróbicas. En la fase logarítmica temprana, la máxima estimulación sobre el control se observó en presencia de 3 µM de insulina (actividad específica: 701 U/mg proteína, 404% de estimulación; actividad absoluta: 1,73 U/10(6) células, 652% de estimulación), sugiriendo un efecto sobre la regulación de la expresión genética de la enzima. La presencia de 1,2-3 µM de la hormona estimuló en 51-68% la expresión de las proteínas citoplasmáticas y, a concentraciones mayores (4,5-9 µM), también estimuló en 25-32% la proliferación celular, indicando hiperplasia e hipertrofia celular de acuerdo a la concentración de la insulina en el medio. El efecto de la hormona disminuyó en la fase logarítmica tardía de crecimiento, sugiriendo un periodo de acción, posiblemente por un mecanismo regulatorio dependiente de nutrientes. Este sistema puede servir como modelo para estudiar muchos de los efectos moleculares de la insulina no conocidos aún.

Saccharomyces cerevisiae yeast is sensitive to mammal’s insulin and acts in carbohydrate metabolism. Nevertheless, there are no studies of its effects on the glycolytic enzymes of this microorganism. This study shows that insulin stimulates pyruvate kinase activity in S. cerevisae during its growth in rich glucose supplemented media, and under aerobic conditions. In the early logarithmic phase, the maximum stimulation over control was seen in presence of 3 µM insulin (specific activity: 701 U/mg protein, 404% stimulation; absolute activity: 1.73 U/10(6) cells, 652% stimulation), suggesting an effect over the regulation of the genetic expression of the enzyme. The presence of 1.2-3 µM of insulin stimulated the expression of cytoplasmic proteins in 51-68% and at higher concentrations (4.5-9 µM) it also stimulated cell proliferation in 25-32%, indicating cell hyperplasia and hypertrophy according to the hormone concentration in the medium. The effect of the insulin decreased in the late logarithmic growth phase, suggesting a period of action, possibly due to a nutrient dependent regulatory mechanism. This system can serve as model to study many of the molecular effects of insulin not yet known.

Actividad ATP hidrolasa asociada a ribosomas humanos como nuevo indicador para evaluar fármacos in vitro / Human ribosome-associated ATPase activiry as a new indicator for in vitro evaluation of drugs

En todos los ribosomas de mamíferos estudiados hasta el presente se ha identificado una actividad ATP hidrolasa (ATPasa) asociada. Su papel en el mecanismo de síntesis de proteínas está siendo estudiado actualmente y existen evidencias de homología funcional con el factor de elongación 3 (EF3) de hongos. Para caracterizar la actividad ATPasa ribosomal humana, se aislaron ribosomas 80S de placenta humana y se estudiaron los parámetros cinéticos de dicha actividad. La velocidad de hidrólisis (0,50 ± 0,05 nmol Pi/A260 80S/min) a concentración fisiológica de ATP (3 mmol/L) y la constante de catálisis aparente (0,5 ± 0,1 sˉ¹) están en el rango de Vmax (0,65 nmol Pi/A260 80S/min) y Km (58 µmol/L), determinados por análisis de Lineweaver-Burk, también son comparables a los reportados para ribosomas de otros mamíferos. El análisis de Eadie-Hofstee indicó la presencia de cooperativa positiva, con un Km aparente de 15 µmol/L para la forma más activa de la enzima. La ATPasa fue inhibida por metavanadato (inhibidor de EF3), y por los antibióticos emetina (inhibidor de la translocación) y anisomicina (actúa sobre los sitios ribosomales A y E). Además, la actividad no fue afectada por antibióticos específicos para otras funciones ribosomales en eucariotes ni tampoco por bloqueadores del ribosoma bacteriano. La sencillez y bajo costo del ensayo de actividad ATPasa ribosomal lo hacen ideal para el diseño de pruebas de alto rendimiento in vitro que harían posible tomar decisiones tempranas sobre el posible uso terapéutico en humanos de nuevos antibióticos o funguicidas

Optimización de un sistema de traducción in vitro derivado de placenta humana para la evaluación de antibióticos / An in vitro translation system derived from human placenta for evaluation of antibiotics

Un sistema de traducción in vitro derivado de placenta humana es una herramienta útil para estimar el efecto que tendrían antibióticos nuevos sobre la síntesis de proteínas en células humanas. Una modalidad simple de ensayo in Vitro es la síntesis de polifenilalanina o poli(Phe), dependiente del ARN sistético poli(U). Para optimizar este ensayo, se purificó ARNtPhe homólogo, partiendo de ARNt total de placenta, mediante una combinación de cromatografía hidrofóbica y de alta presión en fase reversa (RP-HPLC). Al incorporar el ARNTPhe purificado a los ensayos se duplicó la eficiencia de síntesis de polo(Phe) con respecto a la obtenida con un ARNt total heterólogo de levadura. El sistema de ensayo optimizado fue usado para determinar el efecto de antibióticos sobre la elongación de polipéptidos por ribosomas humanos. La actividad ribosomal eucariota (ciclo-heximida y emetina, IC50 ˜= 40-60 µmol/L y 10-30 µmol/L, respectivamente). Por el contrario, antibióticos que actúan sobre el ribosoma bacteriano (cloranfenicol, azitromicina, y clindamicina) no mostraron efecto inhibitorio aún a concentraciones altas (hasta 1 mmol/L). Estos resultados demuestran la sensibilidad diferencial esperada del sistema in vitro y su potencialidad para ser utilizado en una evaluación temprana y rápida del efecto de antibióticos de nueva generación sobre la síntesis de proteínas con ribosomas humanos. Por lo tanto, el sistema de ensayo in Vitro permitiría seleccionar aquellos compuestos con mejores posibilidades para las pruebas posteriores necesarias para establecer su uso terapéutico en humanos

Effect of Antimalarial Drugs on Plasmodia Cell-Free Protein Synthesis

A cell-free system from Plasmodium falciparum able to translate endogenous mRNA was used to determine the effect of artemisinin, chloroquine and primaquine on the protein synthesis mechanism of the parasite. The antimalarial drugs did not inhibit the incorporation of [³H] methionine into parasite proteins even at concentrations higher than the ones found to strongly inhibit the parasite growth. Results clearly indicate that these compounds do not have a direct effect on protein synthesis activity of P. falciparum coded by endogenous mRNA

An in vitro system from Plasmodium falciparum active in endogenous mRNA translation

An in vitro translation system has been prepared from Plasmodium falciparum by saponin lysis of infected-erythrocytes to free parasites which were homogeneized with glass beads, centrifuged to obtain a S-30 fraction followed by Sephadex G-25 gel filtration. This treatment produced a system with very low contamination of host proteins (<1). The system, optimized for Mg2+ and K+, translates endogenous mRNA and is active for 80 min which suggests that their protein factors and mRNA are quite stable.