TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA HAS DUAL EFFECTS ON MMP9 AND uPA EXPRESSION IN HTR-8/SVneo HUMAN TROPHOBLASTIC CELL LINE / El factor de crecimiento transformante beta tiene efecto dual en la expresión de MMP9 y uPA en la línea celular de trofoblasto _HTR-8/SVneo

ABSTRACT Invasion of trophoblast into endometrium is vital for successful pregnancy development. MMP9 and uPA are key proteases in this process, but it is still not clear the regulation of its expression by Transforming Growth Factor Beta (TGF-β), a known negative regulator of trophoblast invasion. We evaluated the effect of TGF-β on the transcriptional expression of uPA and MMP9 over time, in HTR-8/SVneo trophoblast cells cultured with or without 0.5 % fetal bovine serum, via RT qPCR. The involved transcription factors and signaling pathways were analyzed in silico, using Proscan, Enrich, PCViz and Wiki Pathway. Results showed that TGF-β temporarily regulates the expression of uPA and MMP9. Serum modified the nature of TGF-β's effects on uPA expression, from negative without serum to positive with it, showing opposite effects on MMP9 expression. In silico analysis evidenced different transcription factors for each protease, some belonging to TGF-β signaling pathway, and crosstalk with MAPK and Wnt/β -catenin pathways. The TGF-β dual role is discussed proposing that serum affects the cellular context. Transcriptional regulation of MMP9 and uPA by TGF-β is differential and depends on serum presence and evaluation time.

RESUMEN La invasión del trofoblasto al endometrio es vital para el correcto desarrollo del embarazo. Las proteasas MMP9 y uPA son claves en este proceso, pero aún no es clara la regulación de su expresión por parte del Factor de Crecimiento Transformante beta (TGF-β), conocido por sus acciones no invasivas sobre el trofoblasto. En este trabajo evaluamos el efecto del TGF-β sobre la expresión transcripcional de uPA y MMP9 en células de la línea de trofoblasto HTR-8/SVneo cultivadas con o sin suero fetal bovino al 0,5 %, mediante RT qPCR. Se analizaron in sillico los potenciales factores de transcripción y vías de señalización involucradas empleando Proscan, Enrich, PCViz y WikiPathway. Los resultados muestran que el TGF-β regula temporalmente la expresión de uPA y MMP9. El suero modificó la naturaleza del efecto del TGF-β sobre la expresión de uPA, de negativo en ausencia de suero a positivo en presencia de este, presentando efectos opuestos para la expresión de MMP9. El análisis in sillico evidenció diferentes factores de transcripción para cada proteasa, algunos pertenecientes a la vía de señalización del TGF-β, y un entrecruzamiento con la vía MAPK y Wnt/β-catenina. Los resultados sugieren que la regulación transcripcional de MMP9 y uPA por parte del TGF-β es diferencial y depende de la presencia de suero y tiempo de evaluación.

Implementación de una metodología para la separación de proteomas de plasma humano mediante electroforesis bidimensional / Implementation of a methodology to separate human plasma proteomes by two-dimensional electrophoresis / Implementação de uma metodologia para a separação do proteoma do plasma humano por eletroforese bidimensional

En este trabajo se implementaron las condiciones para la separación de proteomas de plasma sanguíneo por electroforesis bidimensional. En muestras de plasma de infante y adulto se evaluaron dos sistemas de pretratamiento de la muestra para reducir el rango dinámico de las proteínas: inmunodepleción de proteínas abundantes y enriquecimiento de proteínas de baja abundancia. Los proteomas se separaron por electroforesis bidimensional y las imágenes se analizaron con el programa Melanie 7.0. Se encontró que ambos métodos de pretratamiento fueron reproducibles y permitieron ver las diferencias en los proteomas de infante y adulto, como muestran los análisis de componentes principales y de clasificación jerárquica tipo heatmap. El porcentaje de recuperación de proteínas fue mayor con la inmunodepleción en comparación con el enriquecimiento proteico. Estos resultados permitieron concluir que con la inmunodepleción, se tiene mayor control de las proteínas eliminadas y por tanto menor pérdida de información, lo que permite su aplicación en estudios exploratorios para la identificación de potenciales biomarcadores de enfermedad.

The conditions to separate blood plasma proteomes by two-dimensional electrophoresis were implemented. In plasma samples from infant and adult two sample pretreatment systems to reduce the proteins dynamic range were evaluated: Immunodepletion of abundant proteins and protein-enrichment of low abundance proteins. Proteomes were separated by two-dimensional electrophoresis and the images were analyzed using Melanie 7.0. It was found that both pretreatment methods were reproducible and allowed to see the differences in the proteomes of infant and adult, as evidenced by the principal component analysis and heatmap, a type of hierarchic classification. The percent recovery of proteins was greater with the immunodepletion method, compared to the protein enrichment system. With these results, we conclude that reducing the complexity of plasma by immunoaffinity showed better control of unrecovered proteins and therefore less loss of information, which allows its application on exploratory studies to identify potential biomarkers of disease.

O objetivo deste trabalho foi otimizar as condições para a separação de proteomas do plasma sanguíneo por eletroforese bidimensional para sua aplicação na procura de potenciais biomarcadores. Trabalhou-se com amostras de plasma de crianças e adultos, avaliando dois sistemas de pre-tratamento da amostra para diminuir o espectro dinâmico das proteínas, imunodepleção de proteínas abundantes e enriquecimento de proteínas de baixa abundância. Os proteomas foram separados por eletroforese bidimensional e as imagens foram analisadas com o programa Melanie 7.0. Foi encontrado que ambos métodos de pre-tratamento foram reprodutíveis e permitiram observar as diferenças nos proteomas de crianças e adultos, como foram evidenciadas com as análises de componentes principais e de classificação hierárquica tipo heatmap. A porcentagem de recuperação de proteínas foi maior na imunodepleção do que obtido pelo enriquecimento proteico. Estes resultados permitiram concluir que com a imunodepleção há um controle mais eficiente das proteínas eliminadas e assim uma menor perda de informação, isto permite sua aplicação em estudos exploratórios orientados na identificação de potenciais biomarcadores da doença.

Structural features of the two-component systemLisR/LisK suggests multiple responses for the adaptation and survival of Listeria monocytogenes

Se caracterizó la estructura del sistema deregulación de dos componentes LisR/LisK de Listeriamonocytogenes. Se emplearon herramientas bioinformáticas ybases de datos para predecir la estructura e interacciones delas dos proteínas y se modelaron. Los resultados predicenque la proteína LisK está embebida en la membrana celulary su composición modular (dominios HAMP, histidinakinasa and ATPasa) está asociada a su autofosforilación(His-266). Un efecto estímulo respuesta determina lapropagación secuencial de la señal desde la membranacelular hacia componentes citoplasmáticos. A su vez, sepredice que LisR es una proteína citosólica con un dominiode receptor (homólogo a cheY) que incluye el residuofosfo-aceptor (Asp-52) y el dominio de unión a ADN,el cual puede permitir la transmisión de una respuestaespecífica a nivel transcripcional. Los componentes LisR/LisK han sido bioquímica y funcionalmente caracterizadosexperimentalmente en la patofisiología de otros bacilos. Espor ello, que la aproximación de los resultados basados enestructura-función podría facilitar el diseño de inhibidoresespecíficos...

Here, we characterized the structure of the two-component regulatory system, LisR/LisK, in Listeriamonocytogenes. To predict the structure of both proteins and the relationship between them, we employedseveral bioinformatic tools and databases. Based on our results, LisK protein is embedded in the cellmembrane and its modular composition (HAMP, histidine kinase and ATPase domains) is associatedwith its autophosphorylation (His-266). A stimulus-response likely determines the sequential signalpropagation from the bacterial cell surface to its cytoplasmic components. According to our results,LisR is a cytoplasmic protein with a receptor domain (homologous to CheY) that comprises a phosphoacceptorresidue (Asp-52) and a DNA-binding domain, which may allow the transmission of a specifictranscriptional response. LisR/LisK has been experimentally characterized both biochemically andfunctionally in other Bacilli pathophysiology; our structure-function approach may facilitate the design ofsuitable inhibitors...

O objetivo do estudo foi caracterizarestruturalmente o sistema de regulação de dois componentesLisR/LisK de Listeria monocytogenes. Foram utilizadasdiversas ferramentas de bioinformática e bancos de dadospara predizer a estrutura das duas proteínas, modelálase prever suas interações. Os resultados predizemque a proteína Lisk está incorporada na composição damembrana celular e sua composição modular (domíniosHAMP, histidina quinase e ATPase) está associada com asua autofosforilação (His-266). Um efeito de estímulo eresposta determina a propagação sequencial do sinal a partirda membrana celular em componentes citoplasmáticos. Osresultados predizem que LisR é uma proteína citosólicacom um domínio recetor (homólogo a CheY) que inclui oresíduo fosfo-aceitador (Asp-52) e o domínio de ligação aoADN, o que pode permitir a transmissão de uma respostaespecífica a nível transcricional. Como LisR/Lisk foi,química e funcionalmente, caracterizada experimentalmentena fisiopatologia de outros bacilos, esta abordagem baseadana estrutura-função pode facilitar a conceção de inibidoresespecíficos...

Encuesta distrital de demografía y salud Bogotá 2011 / Demographic and health district survey Bogotá 2011

La encuesta distrital de demografía y salud de Bogotá (EDDS) es el primer estudio financiado por el gobierno local, que da cuenta del estado de la salud sexual y reproductiva de las personas que habitan la ciudad. Su importancia radica en la especificidad de la información para Bogotá y sus 20 localidades...

Igf-ii y la gonddotropina coriónica regulan la roliferación, migración e invassión de células de trofoblasto humano / IGF-II and Chorionic Gonadotropin Regulate Proliferation, Migration and Invasion of Human Trophoblast Cells

Son conocidas las propiedades del factor de crecimiento similar a la insulina tipo II (IGF-II) y de la hormona gonadotropina coriónica (hCG) en implantación y migración trofoblástica; sin embargo, los mecanismos moleculares a través de los cuales ejercen sus efectos no están completamente caracterizados. El objetivo de este estudio fue establecer la interacción potencial entre los efectos funcionales de hCG e IGF-II en la regulación de la proliferación, migración e invasión trofoblástica. Utilizando la línea celular HTR-8/SVneo de trofoblasto extravelloso se estableció que IGF-II promueve la proliferación celular y de manera novedosa se demostró que hCG, a concentraciones elevadas, es capaz de estimular la proliferación trofoblástica, a través de un mecanismo independiente al empleado por IGF-II. En contraste, la capacidad invasiva del trofoblasto fue regulada por IGF-II y hCG, planteando la existencia de un efecto aditivo en sus acciones. En conclusión, nuestros resultados demuestran el papel de hCG e IGF-II en la regulación de la proliferación e invasión del trofoblasto y plantean la existencia de interacciones a nivel de sus acciones biológicas, contribuyendo a un mejor entendimiento de la biología del trofoblasto y sus patologías.

Both IGF-II and chorionic gonadotropin (hCG) are important regulators of human trophoblast migration and implantation; however the molecular mechanisms are not fully understood. The purpose of this study was to determine the potential cross-talk between functional effects of hCG and IGF-II in the regulation of trophoblast proliferation, migration and invasion. Using the HTR-8/SVneo trophobast cell line we found that IGF-II stimulates cell proliferation and, for the first time we demonstrate that hCG at high doses is able to promote trophoblast proliferation through a mechanism independent of IGF-II. In contrast, trophoblast invasiveness was regulated by both IGF-II and hCG and an additive effect between the two hormones was observed. In conclusion, our results demonstrate cross-talk between the biological activities of IGF-II and hCG in the regulation of trophoblast invasiveness and contribute to a better understanding of the trophoblast biology and pathology.

El igf-ii estimlla la actividad de mmp-9 y mmp-2 en un modelo de trofoblasto humano / IGF-II Stimulates MMP-9 and MMP-2 Activity in a Human Trophoblast Model

La invasión del útero por el trofoblasto extravelloso de placenta de primer trimestre (EVCT) depende de la secreción de metaloproteasas de matriz (MMPs) que degradan la matriz extracelular y dentro de las cuales las gelatinasas MMP-9 y MMP-2 juegan un papel muy importante. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de los ligandos del sistema de factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) en la actividad de gelatinasas en una línea celular establecida de trofoblasto extravelloso invasivo, HTR8/SVneo. Mediante ensayos de zimografía se encontró que el tratamiento con IGF-II 10 nM estimula la actividad de proMMP-9 y proMMP-2 con un máximo a las 24 horas. Dosis mayores de IGF-II mostraron un efecto inhibitorio en la actividad proteasa. Adicionalmente, el IGFII 10 nM estimuló la actividad de otras dos gelatinasas no identificadas de peso molecular 52 kDa tras tratamiento por 24 horas. Ni la insulina ni el IGF-I en concentraciones 10 nM mostraron un efecto estimulador en la actividad de las gelatinasas. Estos resultados muestran el papel potencial del sistema IGF en la regulación de la invasión celular y ayudan a comprender el desarrollo del crecimiento maligno.

Invasion of the uterus by first trimester placental extravillous trophoblast (EVT) cells depends on matrix metalloproteinase (MMPs) secretion to degrade the extracellular matrix; among these, MMP-2 and MMP-9 gelatinases play a pivotal role. The aim of this work was to determine the effect of ligands of the insulin-like growth factor system (IGF) on gelatinase activity in HTR8/Svneo cells, a well-established invasive extravillous trophoblast cell line. By zymography assay, we found that treatment with 10 nM IGF-II stimulates proMMP-9 and proMMP-2 activity with a peak at 24 hours, whereas higher IGF-II doses showed an inhibitory effect on the protease activity. Additionally, IGF-II stimulation resulted in the activation of two other gelatinases, with MW around 52 kDa, which remain to be identified. Neither insulin nor IGF-I were able to stimulate the activity of gelatinases at the time and doses utilized in this study. These results support the potential role of the IGF system in the regulation of cell invasion and malignant growth.

Señalización asociada al receptor del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo I en una línea celular colombiana de carcinoma mamario / Insulin-like growth factor receptor I signaling in a breast cancer cell line

Introducción. Varios estudios in vitro sugieren que la proliferación, migración y supervivencia en líneas celulares de cáncer de seno se ven significativamente afectadas por la activación del receptor IGF de tipo I (Insulin-like Growth Factor-I Receptor, IGF-IR).Objetivo. Caracterizar la fosforilación del IGF-IR y las moléculas de señalización intracelular Akt y Erk1/2 (vías de señalización PI-3K y MAPK, respectivamente), causada por el factor IGF-I en una línea celular colombiana de cáncer de mama ductal infiltrante (CSC 1595). Materiales y métodos. Las líneas celulares CSC 1595 y MCF-7 se cultivaron en medio DMEM con suplemento de suero fetal bovino 10%, glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml a 37 0C, atmósfera de CO2 al 5% y humedad de 95%. Los extractos celulares se sometieron a inmunoprecipitación e inmunodetección con anticuerpos específicos anti-pIGF-IR, anti-pERK1/2 y anti-pAkt. Resultados. Cinco minutos después del estímulo con 10 nM de IGF-I, 70% y 25% del IGF-IR fueron fosforilados en las células CSC 1595 y MCF-7, respectivamente; también se observó activación de las proteínas Akt y ERK1/2. Los niveles basales y estimulados de las proteínas ERK1/2 fueron significativamente más altos en las células CSC 1595, comparados a los observados en MCF-7. Conclusiones. El IGF-IR y la vía MAPK cinasa que involucra las proteínas ERK1/2 muestran una fosforilación mayor en las células 1595 a la observada en las MCF-7. El IGF-IR, principal activador de esta vía, podría jugar un papel importante en los procesos de proliferación y metástasis de tumores de cáncer de mama ductal infiltrante.

Introduction. In vitro studies strongly suggest that proliferation, migration and cell survival of breast cancer cell lines are significantly affected by activation of the IGF type 1 receptor (IGF-IR).Objective. The phosphorylation by IGF-I of IGF-IR and the intracellular signaling molecules Akt (PI-3K pathway) and Erk1/2 (MAPK pathway) was characterized in a human breast cancer cell lines. Materials and methods. The study compared a standard breast adenocarcinoma line (MCF-7) cell line with a line (CSC 1595) derived from an infiltrating ductal breast cancer in a Colombian patient. The CSC 1595 and MCF-7 cell lines were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 U/ml penicillin, and 100 µg/ml streptomycin and grown at 37°C in 5% CO2 atmosphere and 95% humidity. Cell extracts were prepared, followed by immunoprecipitation and immunoblotting with specific anti-pIGF-IR, anti-pERK1/2 and anti-pAkt antibodies. Results. After 5 minute stimulation with IGF-I, 70% of the IGF-IR was phosphorylated in the cell line CSC 1595 and 25% in MCF-7. In addition, Akt (oncogene protein v-akt) and ERK1/2 (extracellular signal-regulated MAP kinases) were phosphorylated. Basal and stimulated levels of phosphorylated ERK1/2 were substantially higher compared to those in the MCF-7 cell line. Conclusions. The IGF-IR and MAPK kinase pathway involving proteins ERK1/2 showed more significant phosphorylation in the 1,595 cells compared to the observed in the MCF-7 cell line. Since the IGF-IR is the major activator of this pathway it may play an important role in ductal infiltrating breast cancer tumor growth and metastases.

Cambios en conocimientos, actitudes y aptitudes sobre bioseguridad en estudiantes de los últimos años de Medicina / Biosecurity knowledge, aptitude and attitude among medical students in the last years of medical school

Objetivo: Determinar el conocimiento, aptitud y actitud sobre enfermedades transmisibles por sangre y las precauciones universales de bioseguridad en estudiantes de medicina de los últimos años de estudios. Material y Métodos: Se realizó una encuesta a estudiantes de medicina del quinto año, (Grupo A), en diciembre del 2005 y luego a estudiantes de medicina del último año (grupo B), de enero a agosto del 2006. Resultados: Se realizaron 214 encuestas: 110 pertenecían al grupo A y 104 pertenecían al grupo B. El grupo A tuvo una edad promedio de 23 años (22,24) y el grupo B de 24 años (23,25). El 54,13 por ciento del grupo A fueron varones y del grupo B fueron 56,73 por ciento. El 61,73 por ciento de grupo B obtuvo calificación aprobatoria en la encuesta en comparación con 38,27 por ciento del grupo A (p=0,003). El grupo B tuvo 70 por ciento más probabilidad de tener buena información en comparación con el grupo A. Asimismo el grupo B tuvo 5,32 veces más accidentes que el grupo A. Conclusiones: Se encontró que tener mayor experiencia en la práctica clínica predice mayor conocimiento de bioseguridad. Se observó menor aplicación de medidas de bioseguridad en el uso de material de protección en los estudiantes con mayor experiencia.

Objective: To determine the change in the knowledge, aptitude and attitude towards transmissible diseases caused by blood, and universal biosafety precautions in medical students. Materials and Methods: In December of 2005, the students of the 5th year (Group A) were evaluated by means of a survey elaborated to collect information about knowledge, aptitude and attitude in biosafety norms. Afterwards this survey was taken by last year medical students (Group B) from January to august of 2006. Results: A total of 214 surveys were obtained. 110 belonging to group A and 104 to group B. Group A had an average age of 23 (22.24) and group B and average of 24 (23,25). 54,13 per cent of group A were male and 56,73 per cent in group B. 61,73 per cent of group B obtained good results in the survey compared to the 38,27 per cent of group A (p=0,003). Group B had 70 per cent more chances of getting good information in comparison to group A. Moreover group B had 5,32 times more accidents than group A. Conclusion: To have more experience in clinical practice predicts a better knowledge in biosafety. Students with more experience in clinical practice were more careless using protective materials.

LA ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN PI3K/AKT POR EL FACTOR DE CRECIMIENTO SIMILAR A LA INSULINA TIPO II ESTIMULA LA EXPRESIÓN DEL mARN DE LA METALOPROTEINASA 9 EN CÉLULAS DE CORIOCARCINOMA / ACTIVATION OF THE PI3K/AKT SIGNALLING PATHWAY BY INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR TYPE II STIMULATES METALLOPROTEINASE 9mRNA EXPRESSION IN CHORIOCARCINOMA CELLS / PERCURSO SINALIZAÇÃO PI3K/AKT ACTIVADO POR INSULINA-COMO FACTOR DE CRESCIMENTO TIPO II ESTIMULA METALOPROTEINASE 9 mARN EXPRESION CORIOCARCINOMA EM CÉLULAS

Las metaloproteinasas 2 y 9 (MMP-2 y MMP-9) y el inhibidor-1 de MMP (TIMP-1) podrían contribuir a la regulación del comportamiento invasivo de las células trofoblásticas, efecto que podría ser mediado por el factor de crecimiento similar a la insulina tipo II (IGF-II), el cual regula el desarrollo y la función del trofoblasto en la interfase materno-fetal. El objetivo de este estudio fue investigar el rol de la vía de señalización PI3K/AKT activada por IGF-II en la expresión de MMP-2 y MMP-9 involucradas en el proceso de invasión en la línea celular JEG-3, de coriocarcinoma humano. La expresión del mARN de MMP-2, MMP-9 y TIMP-1 fue evaluada, en dichas células, por la técnica de RT-PCR empleando diferentes dosis de IGF-II y diferentes condiciones, mientras que la vía de señalización fue evaluada usando la técnica de Western blot. Se encontró que el IGF-II no contribuye a la proliferación de las células trofoblásticas; sin embargo, este promueve la expresión del mARN de MMP-9 y TIMP-1 pero no de MMP-2, de forma dependiente de la dosis. El efecto en la expresión de MMP-9 es mediado a través de IGF-II por la activación de la vía de señalización PI3K/ AKT después de la fosforilación del receptor de IGF-I (IGF-IR). De acuerdo con los resultados, se propone un modelo en el cual la interacción de IGF-II con IGF-IR conduce a la activación de PI3K/AKT y la subsecuente expresión y activación de MMP-9. Esta activación es un requisito esencial para el proceso invasivo.

Metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) and TissueInhibitor-1 ofMMPs (TIMP-1) could contribute to regulate the invasive behaviour of trophoblastic cells, effect which could be mediated by Insulin-like growth factor type II (IGF-II), which regulates the development and function of trophoblast at the foetal-maternal interface. The aim of this study was to investigate the role of the PI3K/AKT signalling pathway activated by IGF-II in the expression of MMP-2 and MMP-9 involved in the invasion process in the human choriocarcinoma cell line JEG-3. MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 mARN expression in those cells were evaluated by RT-PCR using different IGF-II doses and conditions while signalling pathway was evaluated using Western blot. It was found that IGF-II does not contribute to trophoblastic cells proliferation, however, it promotes mARN expression of MMP-9 and TIMP-1, but not of MMP-2, in a dose-dependent way. The effect on MMP-9 expression is mediated through IGF-II activation of PI3K/AKT signalling pathway after phosphorylation of the IGF-I receptor (IGF-IR). According with the results a model is proposed in which the interaction of IGF-II with IGF-IR leads to PI3K/AKT activation and subsequent expression and activation of MMP-9. This activation is an essential requirement for the invasive process.

As metaloproteinasas 2 y 9 (MMP-2 y MMP-9) e o inibidor-1 de MMPs (TIMP-1) poderiam contribuir à regulação do comportamento invasivo das células trofoblásticas, efeito que poderia ser mediado pelo Factor de Crescimento Similar à Insulina tipo II (IGF-II), o qual regula o desenvolvimento e função do trofoblasto na interface materno-fetal. O objectivo deste estudo foi investigar o papel da via de sinalização PI3K/AKT activada por IGF-II na expressão de MMP-2 e MMP-9 envolvidos no processo de invasão na linha celular JEG-3, de coriocarcinoma humano. A expressão do mARN de MMP-2, MMP-9 y TIMP-1, foi avaliada, em ditas células, pela técnica de RT-PCR utilizando diferentes doses de IGF-II e diferentes condições, enquanto que a via de sinalização foi avaliada usando a técnica de Western-blot. Foi encontrado que o IGF-II não contribui à proliferação das células trofoblásticas, no entanto, este promoveu a expressão do mARN de MMP-9 e TIMP-1 mas não de MMP-2, de forma dependente da dose. O efeito na expressão de MMP-9 é mediado através de IGF-II pela activação da via de sinalização PI3K/AKT depois da fosforilação do receptor de IGF-I (IGF-IR). De acordo aos resultados é proposto um modelo, no qual a interacção de IGF-II com IGF-IR conduz à activação de PI3K/AKT e à subsequente expressão e activação de MMP-9. Esta activação é um requisito essencial para o processo invasivo.

RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE mARN DE LAS METALOPROTEINASAS 2 Y 9 Y EL INHIBIDOR TIMP-1 EN MOLA HIDATIDIFORME COMPLETA / RELATIONSHIP BETWEEN METALLOPROTEINASES 2 AND 9 AND TIMP-1 INHIBITOR mRNA EXPRESSION IN HYDATIDIFORME MOLE / RELAÇÃO DA EXPRESSÃO DE mRNA DAS METALOPROTEINASAS 2 E 9 E DO INHIBIDOR TIMP-1 NA MOLA HIDATIDIFORME COMPLETA

Durante el comienzo de la gestación el factor de crecimiento similar a la insulina tipo II (IGF-II) se expresa abundantemente en la placenta y podría regular el comportamiento invasivo de las células trofoblásticas. La habilidad invasiva dependerá también de la capacidad de secretar metaloproteinasas (MMPs), cuya expresión anormal contribuye a varios procesos patológicos. En la Enfermedad Trofoblástica Gestacional (ETG) estos factores podrían estar desregulados, así la mola hidatidiforme completa (MHC) conduce a la formación del coriocarcinoma, que es un tumor invasivo y metastásico. El objetivo de este estudio fue investigar la relación entre los niveles de mARN de IGF-II, MMP-2, MMP-9 y TIMP-1, por la técnica de RT-PCR, en tejidos de mola hidatidiforme vs. placentas de primer trimestre. La actividad de las MMPs se evaluó usando el ensayo de zimografía, encontrando que en MHC ésta se incrementa, lo cual podría relacionar la malignización del trofoblasto con el incremento en su capacidad invasiva. La expresión elevada de IGF-II en esta patología, también podría estar asociada con el incremento en la actividad de estas MMPs. Una mayor relación entre la expresión de mARNde MMP-9/TIMP-1 en la mola hidatidiforme completa se sugiere como predictor de malignización del tejido trofoblástico .

At the beginning of gestation the Insulin Like Growth Factor II (IGF-II) is highly expressed in placenta and it could regulate the invasive behavior of trophoblastic cells. This invasive ability depends on its capability to secret metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs), abnormal expression of which could contribute to several pathological processes.In the Gestational Trophoblastic Diseases (GTD) these factors could be unregulated, in this way complete hydatidiforme mole (CHM) produces the choriocarcinoma which is an invasive and metastasic tumor. The aim of this study was to investigate the relationship between IGF-II, MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 mRNA levels by RT-PCR technique, in hydatidiform mole tissues vs. first normal trimester placentas. MMPs activity was evaluated using zimography assay finding that in CHM this is increased, which could relate trophoblast malignization with an increased invasive capability. The higher IGF-II mRNA expression in this pathology could, also, be associated with increased MMPs activity. A higher MMP-9/ TIMP-1 mRNA expression ratio in CHM is suggested as a predictor of trophoblastic tissue malignization .

No início da gestação o fator de crescimento semelhante à insulina tipo II (IGF-II) é altamente expresso na placenta e poderia regular o comportamento invasivo das células trofoblásticas. Esta habilidade invasiva também depende da sua capacidade de produzir metaloproteinasas (MMP) e inibidores das mesmas (TIMP), expressão anormal da qual poderia contribuir em vários processos patológicos. Nas Doenças Trofoblásticas da Gestação (Gestational Trophoblastic Disease, ETG) estes fatores poderiam ser desregulados; deste modo a Mola Hidatidiforme Completa (MHC) produz coriocarcinoma que é um tumor invasivo e metastásico. O objetivo deste estudo era pesquisar a relação entre os níveis de mRNA do IGF-II, MMP-2, MMP-9 e TIMP-1, através da técnica de RT-PCR em tecidoos da MHC vs. placenta do primeiro semestre. Atividade das MMP foram avaliadas pelo ensaio de zimografia achando que em MHC aumenta; isto poderia relacionar o incremento do malignidade do trofoblasto com uma capacidade invasiva aumentada. A expressão mais alta do IGF-II nesta patologia pode também estar associada com atividade aumentada destas MMP. Uma relação aumentada da expressão do mRNA de MMP-9/TIMP-1 na MHC é sugerida como um preditor do incremento da malignidade do tecido trofoblástico .

Estudio inmunocitoquímico y molecular de cultivo primario de tejido molar / Immunocytochemical and molecular studies with primary cultures of molar tissue

Introducción. La enfermedad trofoblástica gestacional comprende un conjunto de patologías caracterizadas por crecimiento e invasión anómalos del trofoblasto. Las bases moleculares de esta patología son desconocidas, en parte por la dificultad para disponer de modelos biológicos adecuados. Se plantea que el sistema de factores de crecimiento similares a la insulina puede tener un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad. Objetivo. Caracterizar cultivos primarios de placentas de primer trimestre provenientes de pacientes con mola hidatidiforme completa y aborto espontáneo no molar mediante morfología, inmunocitoquímica y expresión diferencial de algunos genes del sistema de factores de crecimiento similares a la insulina. Materiales y métodos. Se empleó inmunocitoquímica para determinar células trofoblásticas y detección por transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa de genes del sistema de factores de crecimiento similares a la insulina asociados al tipo celular. Resultados. La morfología evidenció heterogeneidad de los cultivos, incluidas células mesenquimales, trofoblásticas y de decidua. El contenido de células de trofoblasto con citoqueratina-7 (marcador específico) estuvo entre 16 y 37 por ciento. La expresión de genes corroboró la presencia de trofoblasto por medio del ARNm del factor II de crecimiento similar a la insulina, en tanto que los transcritos de la hormona de crecimiento variante evidenciaron la presencia de sincitiotrofoblasto. El factor I de crecimiento similar a la insulina y la proteína de unión tipo 1 se relacionaron con células mesenquimales y de decidua. Se observó una mayor expresión del factor II de crecimiento similar a la insulina en tejidos molares en comparación con aborto no molar. Conclusiones. Los resultados mostraron la utilidad de combinar tres metodologías, morfología, inmunocitoquímica y expresión de genes, como herramientas para la caracterización y seguimiento de cultivos placentarios a partir....

Introduction. Gestational trophoblastic disease includes a group of pathologies characterized by abnormal trophoblast growth and invasion. The molecular bases of the disease are largely unknown, due in part to the lack of appropriate biological models. The insulin-like growth factor (IGF) system plays a fundamental role in the growth and development of many tissues and is involved in the progression of several diseases. Objectives. Primary cell cultures derived from first trimester placenta were characterized from patients with complete hydatidiform mole and spontaneous non molar abortion by immunocytochemical and molecular methods. Materials and Methods. The immunocytochemical method used specific markers for trophoblastic cells, whereas RT-PCR was used to identify insulin-like growth factor gene expression. Results. Histochemical staining with hematoxilin-eosin revealed that the cultures contained heterogeneous cell types, including trophoblast and endometrial decidual cells. The ratio of trophoblast cells in the cultures varied between 16% and 37%, as detected by cytokeratine-7 as the specific trophoblast marker. Gene expression analysis corroborated the presence of trophoblasts by detecting insulin-like growth factor II mRNA, whereas GH-V transcripts were correlated with the presence of syncitiotrophoblasts. Insulin-like growth factor I and insulin-like growth factor binding protein 1 mRNAs were related to mesenchyimal and decidual cells, respectively. Higher insulin-like growth factor II expression levels were found in molar tissues in comparison with non-molar abortions. Conclusion. By combining three methodologies—morphology, immunocytochemistry and gene expression, characterization and follow-up of placenta cultures from abnormal tissues is found to facilitate diagnosis.

Extracción de ADN, ARN y proteínas de células cervicales provenientes de cepillados cervicales tomados para citología cérvico-uterina / DNA, RNA and Protein extraction from exfoliated cervical cells taken

Introducción: La citología cérvico-uterina (CCU) en el método más empleado en el tamizaje de lesiones precancerosas de cuello uterino. Sin embargo, la CCU tiene una proporción importante de falsos positivos y negativos, y sólo una minoría delesiones precancerosas identificadas desemboca en cáncer de cuello uterino.Objetivo: Analizar si de los cepillados cervicales es posible extraer ADN, ARN y proteínas útiles para estudios de marcadores de carcinogénesis cervical.Métodos: Se recolectaron 281 cepillados cervicales. ADN, ARN y proteínas de las células cervicales fueron extraídos empleando Trizol. Se realizó PCR para el gen de la beta globina, para evaluar el ADN extraído y RT-PCR de GAPDH y UBC, para evaluar el ARN extraído. Mediante PCR en tiempo real se cuantificó el número de copias de UBC. Las proteínas fueron cuantificadasempleando el método del ácido biscinconínico. Resultados: Nueve muestras fueron negativas para PCR de beta globina (3,2%). Otras nueve fueron negativas para RT-PCRde GAPDH (3,2%), pero 176 fueron negativas para RT-PCR de UBC. Las 105 muestras restantes fueron positivas para UBC empleando PCR en tiempo real. Las proteínas extraídas estuvieron en el rango de 30 a 4559 [mi]g/ml, dos de las 281 muestras fueron negativas para proteínas por el método del ácido biscinconínico. Conclusión: De los cepillados cervicales se puede extraer ADN, ARN y proteínas útiles para la búsqueda de marcadoresmoleculares en cáncer de cuello uterino; sin embargo, por el tipo de muestra analizado se recupera menos ARN. El usode RT-PCR de GAPDH para evaluar la calidad del ADN complementario sintetizado puede dar falsos positivos debido a la presencia de seudogen procesado. Se recomienda el uso de otros genes constitutivos como UBC.

Introduction: Papanicolau (Pap) test is the most employed screening test for precancerous cervical lesions. However, this test has an important proportion of false positives and false negatives, only a minority of the identified lesions will progress to cancer. Objective: To evaluate the remnant of cervical scrapes after the preparation of the slide as source of DNA, RNA and proteinsfor search of molecular markers of progression of precancerous lesions.Methods: DNA, RNA and proteins were extracted from 281 cervical scrapes using Trizol. To evaluate the quality of DNA a PCR for beta globine was used, RNA quality was tested by RT-PCR of GADPH and UBC genes. Real time PCR was used to evaluate the number of RNA copies of UBC gene. The protein level was obtained by the biscinconinic acid method. Results: Nine samples were negative for beta globin PCR (3,2%), 9 samples were negative for GAPDH RT-PCR (3,2%) and 176 samples were negative by UBC RT PCR , the remnant 105 were positive for UBC in real-time PCR. The extracted proteinswere in a rank between 30 and 4559 [mi]g/mL, two of 281 samples were negative for proteins. Conclusion: From cervical scrapes is possible to extract DNA, RNA and proteins usable in biomarkers research, however therecovery of RNA is lower, this can due to some characteristics inherent to the cervical cells. The use of GAPDH as in RT PCR to evaluate DNA quality can generate false positives due to the presence of a processed pseudogen, it is recommended the use of other constitutive gen like UBC.

Serum levels of insulin-like growth factor-I and -II and insulinlike growth factor binding protein 3 in women with squamous intraepithelial lesions and cervical cancer / Niveles séricos de los factores de crecimiento similares a la insulina I y II y su proteína 3 de enlace en mujeres con lesiones escamosas intraepiteliales y cáncer de cuello uterino

Introduction. Pap smear has limitations as a screening test for cervical cancer. A marker that allows the identification of women who are at risk of developing cervical cancer would be useful for its prevention. A growing number of studies have demonstrated an association between insulin-like growth factors (IGF) serum levels and increased risk for various cancers. Objective. To assess whether circulating IGF-I, IGF-II, or IGF binding protein 3 (IGFBP-3) were associated with cervical cancer and low-grade and high-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL and HSIL). Materials and methods. Serum levels of IGF-I, IGF-II and IGFBP-3 were measured by ELISA. Three groups of cases were analyzed: LSIL (n = 37), HSIL (n = 57), and cervical cancer (n = 41). For each case, two controls, matched by age, were included. Control subjects were women with normal, HPV-DNA-negative Pap smear. Results. Significantly lower values of IGF-I (83.9 ng/ml versus 126.6 ng/ml, p < 0.001) and IGFI: IGFBP-3 molar ratio (0.094 versus 0.137, p < 0.001) were observed among cancer cases, as compared to their control group. Women in the highest quartile of IGF-I and IGF-I:IGFBP-3 molar ratio were at an 80 por ciento (OR = 0.2, 95 por ciento CI [0.06-0.61]) and a 77 por ciento (OR = 0.23, 95 por ciento CI [0.07- 0.73]) lower risk of cervical cancer, respectively, compared with women in the corresponding reference category. Conclusions. These data suggest that low values of IGF-I and IGF-I:IGFBP-3 molar ratio may be associated with cervical cancer.

Protein malnutrition up-regulates growth hormone receptor expression in rat splenic B lymphocytes / La desnutrición proteica estimula la expresión de receptores de la hormona del crecimiento en linfocitos B esplénicos de rata

La interacción recíproca entre los sistemas endocrino e immune ha sido objeto en la última década de numerosas investigaciones que han aportado evidencia sustancial sobre el papel del eje GH/IGF-I en el sistema inmune. Recientemente, se ha postulado que el eje GH/IGF-I ejerce una función importante en la modulación de condiciones de estrés, tales como estados catabólicos, trastornos asociados con el envejecimiento, síndrome de inmunodeficiencia adquirida y desnutrición. No se conoce aún si estos efectos son ejercidos a través de mecanismos endocrinos, autocrinos o paracrinos en los diferentes tipos de tejidos del sistema inmune. El objetivo de este estudio fue establecer los principales subtipos celulares linfoides que son blanco de la acción de la hormona de crecimiento. Además, se estudió el efecto regulador del estrés inducido por la desnutrición proteica sobre la distribución relativa de células linfoides positivas al receptor de GH (GHR). Ratas normales se sometieron a dietas isocalóricas de contenido variable de proteína (0, 4, 8, 12 y 20 por ciento) durante 14 días y se aislaron los linfocitos de bazo, ganglios linfáticos y sangre periférica. Mediante citometría de flujo se analizó la unión a Fluos-rrGH y los linfocitos CD4+, CD8+ y B se definieron empleando anticuerpos monoclonales específicos marcados con PE. Se encontró que el patrón de expresión de GHR varía con el tejido y tipo celular linfoide. El bazo es el órgano más sensible al déficit de proteína, y la mayor expresión de receptores para GH se presenta en las células B seguidas por las células CD4+. Al reducir el contenido de proteína en la dieta de 20 por ciento a 0 por ciento se observó un incremento del 12 por ciento al 52 por ciento en el número de células B positivas para el receptor de GH y del 8 por ciento al 17 por ciento en las células CD4+ positivas para GHR en el bazo. En contraste, sólo el 10 por ciento -13 por ciento de linfocitos de los ganglios linfáticos y 2 por ciento -4 por ciento de la sangre periférica presentaron receptores para GH en su superficie, los cuales no se vieron afectados significativamente por el déficit de proteína. En conclusión, el incremento en los receptores para GH en linfocitos bajo estrés catabólico inducido por la restricción en proteína, apoya la hipótesis del papel modulador del eje GH/IGF-I en la preservación de la homeostasis del sistema inmune

Serum IGF-I and IGFBP-3 levels in pregnant adolescents in an economically depressed community

The growth hormone (GH) insulin-like growth factor-I (IGF-I) axis is believed to play a role in growth during postnatal and fetal life and is regulated by nutrition. However, very few studies have examined the effects of malnutrition on the regulation of the GH/IGF-I axis in human pregnancy during adolescence. In this study we compared the serum IGF-I and IGFBP-3 levels in a group (n=62) of pregnant adolescents in their second trimester of pregnancy and living in a poor area in the city of Bogotá, with those of a group (n=36) of non-pregnant adolescents from the same area. As reference, a group (n=20) of non-pregnant adolescents from a middle-class district in the same city was utilized. It was observed that the non-pregnant adolescents from the poor area were all below the 3rd percentile and showed significantly (p<0.05) reduced height and weight in comparison with subjects from middle-class area, suggesting growth retardation in this group of subjects. Serum IGF-I and IGFBP-3 levels were significantly (p<0.0001) reduced, in comparison with subjects from the middle-class area, although there was no evidence of delay of puberty based on Tanner stage of sexual development and only subjects at Tanner 5 were included in this study. When the serum concentrations of IGF-I and IGFB-3 in the population of pregnant adolescents were investigated, no differences were found with those observed in the non-pregnant adolescents from the poor district, which means that pregnancy was not accompanied by the elevation in IGF-I levels observed in normal pregnancies. In conclusion, the low circulating IGF-I levels observed in pregnant adolescents could mirror abnormalities on the normal physiology of the GH/IGF-I axis, whose effects on fetal growth are not completely understood

Obtención de una sonda específica para evaluar la transcripción del gen STAT5b / Obtaining a specific probe to evaluate STAT5b gene transcription

Se describe la estrategia empleada para clonar, en un vector de expresión, un fragmento de 306 pb del gen de STAT5b de rata, amplificado por la técnica de RT-PCR. Se amplificó una región en el terminal 3' donde se encuentra la mayor diferencia entre las secuencias del cADN de las isoformas STAT5a y STAT5b de rata. La clonación se logró utilizando el nuevo sistema TOPO-TA recomendado para productos de difícil clonación. El fragmento se subclonó en el vector pBlueScrip II SK y se caracterizó mediante secuenciación y análisis de restricción. La subclonación se realizó con el propósito de poder obtener sondas sentido y antisentido de ARN por transcripción in vitro. Esta sonda específica se empleó para cuantificar niveles de mARN de STAT5b en hígado de ratas macho mediante la técnica de hibridización en solución o ensayo de proteción de ARNasas

Purificación y caracterización electroforética de la proteína de unión a GH (GHBP) en suero humano y de pacientes con cáncer y en embarazo: evidencia de la exitencia de una proteína de unión a prolactina (PRLBP) / Purification and electrophoretic characterization of growth hormone binding protein (GHBP) in human, cancer and pregnancy sera: evidence of the presense of prolactin binding protein (PRLBP)

Una de las formas de regulación de la actividad de ciertas citocinas es la generación de formas solubles del receptor, las cuales actúan principalmente como proteínas de unión, aunque también se les han atribuido funciones de carácter agonista. El objetivo de este trabajo fue el de establecer la presencia de proteínas de unión a hormona de crecimiento (GHBP) y prolactina (PRLBP) en suero humano. La GHBP se purificó parcialmente mediante un nuevo método empleando hormona humana de crecimiento (GH, growth hormone) humana inmovilizada sobre Sepharosa y su separación y detección se realizó por medio de electroforesis e inmunotransferencia (Western blot), utilizando un anticuerpo dirigido contra el receptor de GH. Los resultados mostraron que la GHBP de suero humano es una mezcla compleja de proteínas con pesos en el rango de 27 a 62 kDa, relacionadas estructuralmente con el receptor de GH y cuyo origen está por determinarse. El suero proveniente de pacientes con cáncer de seno en estados 3 y 4, así como el de embarazo, mostró el mismo perfil de proteínas aunque sus niveles fueron en todos los casos inferiores a la normalidad, siendo los más bajos los de embarazo. En cuanto a la PRLBP, mediante anticuerpos antirreceptor, se identificó una proteína sérica de 150 kDa disociable en dos subunidades de pesos 50 y 30 kDa, consiste con lo informado por otros autores. De acuerdo con el peso establecido y a su incapacidad para unir hGh, se concluyó que no es una forma soluble del receptor y se sugiere que puede ser un anticuerpo antiidiotípico presente en el suero humano. No se encontraron diferencias en el perfil ni el contenido de las PRLBP en los tres tipos de suero analizados. Los resultados obtenidos ponen en evidencia la exitencia de una proteína de unión a prolactina relacionada con el receptor de PRL y cuyo origen en humanos está por establecerse

Producción de la proteína recombinante JAK2 de ratón / Production of mouse recombinant JAK2 protein

El presente trabajo describe la producción de la proteína recombinante JAK2, empleando un sistema de vectores de expresión baculovirales. La infección de células Sf9, derivadas del tejido de ovario de Spodoptera frugiperda, permitió establecer las condiciones óptimas de dilución del virus en 10 µl/ml de medio y de tiempo de recolección en 72 horas post-infección. Se recolectaron y ultrafiltraron extractos correspondientes a la infección de 5 x 10 a la 7 células, aproximadamente, y se sometieron a cromatografía de intercambio iónico (DEAE-Sephacel), lográndose purificar parcialmente la proteína JAK2 por medio de un gradiente continuo de fuerza iónica (NaCl 10-500 mM). La presencia de JAK2 se verificó por Western blot, empleando un anticuerpo policlonal producido en conejo contra los residuos 758-776 de JAK2 de ratón. Los resultados indicaron que la proteína obtenida por este sistema de expresión se sintetiza en forma fosforilada/activada

Identificación de las principales proteínas de unión a IGF (IGFP) en tejidos de rata normal / Identification of the main IGF binding protein (IGFBPs) in normal rat tissue

En este trabajo se investigó la presencia de las principales proteínas de unión a IGF-I en tejidos de rata y el tamaño de los complejos formados en cada caso. Mediante análisis de Western ligand blot (WLB) y cromatografía de exclusión molecular, se separaron e identificaron cuatro proteínas de unión, correspondientes a las IGFBP-1 a IGFBP-4. En todos los tejidos analizados, se detectó la proteína IGFBP-3, aunque su concentración varió con el tipo de órgano, siendo muy abundante en hígado, riñon y corazón y escasa en órganos linfoides (timo y bazo). IGFBP-1 e IGFBP-2 se identificaron en hígado y pulmón y, además, en corazón y músculo esquelético, órganos donde hasta el momento no se han identificado los correspondientes mARN, como tampoco IGFBP-4, identificada en este trabajo en pulmón. En conclusión, los resultados obtenidos indican un perfil típico para las IGFBP de acuerdo con el tejido, aunque no es claro aún si su presencia es el resultado de su síntesis in situ o de un transporte transcapilar. La identificación de sus mensajeros es un paso esencial para comprender el papel regulador que estas proteínas desempeñan en la biodisponibilidad del IGF-I en los diferentes tejidos

Obtención de una sonda para cuantificar el mARN del factor activador de la transcripción STAT5 en rata / A new probe for use in quantifying STAT5 transcription activator factor in rat mRNA

Se describe la estrategia empleada para clonar, en un vector de expresión, un fragmento del gen de STAT5 amplificado por la técnica de PCR. Variando la concentración de magnesio y la temperatura de alineación, se logró amplificar el fragmento deseado a partir de un cADN de sTAT5b de ratón. El producto de PCR se clonó y se comprobó la identidad de la sonda mediante análisis de restricción y secuenciación. Esta sonda se usó en el ensayo de protección con ribonucleasa A o hibridización en solución, para cuantificar el mARN de STAT5 en hígado y linfocitos de timo de ratas hembras. Se encontró una mayor expresión del mARN de STAT5 en hígado