Obtención de una versión IgG1 de ratón del rituximab para detectar la molécula CD20 humana / Obtaining a mouse IgG1 version of rituximab to detect the human CD20 molecule

Introducción: El rituximab, anticuerpo quimérico que reconoce la molécula CD20 humana, se ha utilizado en el tratamiento de diversos trastornos linfoproliferativos de células B. Para la selección de los potenciales beneficiarios del tratamiento con rituximab se han desarrollado técnicas que, mediante el uso de anticuerpos monoclonales, detectan la presencia del CD20 en los linfocitos de estos pacientes. Objetivo: Obtener y caracterizar un anticuerpo recombinante IgG1 de ratón específico para la molécula CD20 humana, que contenga las regiones variables del anticuerpo rituximab. Métodos: Para la expresión estable del anticuerpo recombinante se empleó la transducción lentiviral de células de embrión de riñón humano (HEK293). La caracterización inmunoquímica del anticuerpo se realizó por la técnica de Western Blot y su capacidad de reconocimiento de la molécula CD20 humana se evaluó por citometría de flujo e inmunohistoquímica. Resultados: Se obtuvo el anticuerpo 1F5 que reconoce, por citometría de flujo, la molécula CD20 en líneas celulares humanas de origen linfoide, así como en células de sangre periférica de humanos sanos y pacientes con trstornos linfoproliferativos de células B. Sin embargo, la técnica de inmunohistoquímica solo permitió detectar con este anticuerpo la molécula CD20 en tejidos frescos, no así en los embebidos en parafina. Conclusiones: Este trabajo sugiere las potencialidades del uso del anticuerpo 1F5 para las mediciones de la expresión de CD20 por citometría de flujo en pacientes con leucemias B o linfomas B avanzados en fase de leucemización. Esto complementaría los estudios para la selección apropiada de pacientes para el tratamiento con el rituximab(AU)

Introduction: Rituximab, chimeric antibody specific for human CD20 molecule, has been widely used in the treatment of several B-cell linfoproliferative disorders. For the selection of patients with the greatest potential to benefit from the therapy with rituximab, a number of techniques using monoclonal antibodies have been developed to detect the CD20 molecule. Objective: To obtain and to characterize a mouse IgG1 recombinant antibody, specific for human CD20, that contains the variable regions of rituximab. Methods: The lentiviral transduction of human embryonic kidney cells (HEK293) was used for the stable expression of the recombinant antibody. The immunochemical characterization of the antibody was performed by Western Blot and the recognition of CD20 was evaluated by immunohistochemistry and flow cytometry. Results: We generated the antibody 1F5, able to recognize by flow cytometry the CD20 molecule expressed on lymphoid human cell lines, as well as peripheral blood mononuclear cells from healthy donors and patients with B-cell lymphoproliferative disorders. However, 1F5 antibody detected the CD20 molecule on fresh tissues, but not on formalin-fixed paraffin embedded tissues,by immunohistochemistry. Conclusions: This work suggests the potential use of 1F5 antibody for the measurement of CD20 expression by flow cytometry in patients with B-cell leukemias or B-cell lymphomas in phase of leukemization. This could complement the studies to ensure the appropriate selection of patients for the treatment with rituximab(AU)

Relación histopatológica de la displasia epitelial con la oncoproteína p53 en la leucoplasia bucal / Histopathological relation of epithelial dysplasia to p53 oncoprotein in oral leukoplakia

La leucoplasia bucal es una lesión precancerosa bien conocida debido a su asociación con la presencia de displasia epitelial y su tendencia a la transformación maligna. Con el fin de eliminar la subjetividad en la determinación de los grados de la displasia epitelial se han utilizado marcadores biológicos, entre ellos, el AcM anti p53. Por ello se propuso evaluar la expresión del AcM anti p53 en los diferentes grados de displasia epitelial en la leucoplasia bucal. Se emplearon las biopsias de 46 pacientes con diagnóstico de leucoplasia bucal, procedentes del Departamento de Patología Bucal de la Facultad de Estomatología de La Habana. Las muestras fueron procesadas por la técnica de inclusión en parafina y coloreadas con la técnica inmunohistoquímica del complejo avidina-biotina-peroxidasa para el AcM p53. Se estudió la correlación entre el patrón de inmunoensayo para p53 y el grado de displasia epitelial. Se evidenció que existe una asociación significativa entre la inmunocoloración de las células basales y suprabasales del epitelio con la oncoproteína p53, en los distintos grados de severidad de la displasia epitelial, lo que pudiera estar relacionado con el incremento progresivo de atipia celular observada. Se concluyó que en las muestras estudiadas existió una relación coincidente del aumento del grado de severidad de la displasia epitelial, con el marcaje de la oncoproteína p53. Estas evidencias sugirieron que el análisis inmunohistoquímico de p53 en conjunto con los parámetros histológicos, principalmente relacionados con el grado de severidad de la displasia epitelial, pudiera ser utilizado para lograr un diagnóstico más certero y contribuir a la prevención del cáncer bucal(AU)

The oral leukoplasia is a well known precancerous injury due to its association with the presence of epithelial dysplasia and its trend to malignant transformation. To eliminate the subjectivity in the determination of the epithelial dysplasia degrees, biological markers have been used among them the AcM.antip53 Thus, authors assessed the expression of AcM antip53 in the different degrees of epithelial dysplasia in the oral leukoplasia. Biopsies from 46 patients diagnosed with oral leukoplasia were used from the Oral Pathology Department of the Stomatology Faculty of La Habana. Samples were processed by the paraffin-inclusion technique and stained with immunohistochemical technique of the avidin-biotin-peroxidase complex for the AcM p53. The correlation between the immunoassay pattern for p53 and the degree of epithelial dysplasia was studied. It was demonstrated that there is a significant association between the immunostain of basal and supra-basal cells of epithelium with the p53 oncoprotein in the different degrees of severity of the epithelial dysplasia, which could be related to the progressive increase of the observed cellular atypia. We concluded that in the study samples there was a coincident relation of the increase in the degree of severity of the epithelial dysplasia, with the marking of the p53 oncoprotein. These evidences suggested that the immunohistochemical analysis of p53 overall with the histological parameters mainly those related to the degree of severity of the epithelial dysplasia could be used to made a more accurate diagnosis and to contribute to prevention of oral cancer(AU)

Caracterización histopatológica de la leucoplasia bucal en La Habana durante 10 años / Histopathological characterization in the leukoplakia buccalis in Havana during 10 years

La displasia epitelial es considerada el más fuerte predictor histológico de la futura transformación maligna de la leucoplasia bucal. El objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia y severidad de la displasia epitelial y su asociación con las alteraciones histológicas de los tejidos epitelial y conectivo de la mucosa en la leucoplasia bucal. Se efectuó una investigación descriptiva y transversal de 83 biopsias procesadas mediante la técnica de inclusión en parafina y coloreadas con hematoxilina y eosina, de pacientes con diagnóstico de leucoplasia bucal entre los años 1991 y 2001, procedentes de la Facultad de Estomatología de la Universidad de Ciencias Médicas de La Habana, Cuba. Se encontró que 92,8 por ciento de los pacientes con diagnóstico clínico de esta enfermedad tuvieron displasia epitelial, de estos y acorde a su grado de severidad, se encontró displasia epitelial ligera en 53,0 por ciento, displasia epitelial moderada en 36,4 por ciento y displasia epitelial severa en 10,4 por ciento. La paraqueratosis se manifestó como sigue: asociada a la displasia epitelial ligera en 43,9 por ciento de los pacientes, a la displasia epitelial moderada en 78,6 por ciento y a la displasia epitelial severa en 100,0 por ciento. La hiperplasia epitelial se presentó en 57,1 por ciento de los casos y el infiltrado inflamatorio en 79,2 por ciento de las muestras examinadas. Se concluyó que en la muestra de leucoplasia bucal estudiada existió un porcentaje elevado de displasia epitelial, con predominio de su grado ligero y una asociación entre el grado de severidad con los diversos patrones de queratinización y la intensidad del infiltrado inflamatorio, lo que se consideró importante al analizar su evolución ante un diagnóstico determinado y su pronóstico.

The epithelial dysplasia is considered the stronger predictor of a future malignant transformation of the leukoplakia buccalis. The aim of present paper was to determine the presence and severity of this type of dysplasia and its association with the histological alterations of epithelial and connective tissues of mucosa in the leukoplakia buccalis. A cross-sectional and descriptive research was conducted in 83 biopsies processed by technique of paraffin inclusion and stained with Hematoxylin and Eosin of patients diagnosed with this entity between 1991-2001 from the Stomatology Faculty of the Medical Sciences University of La Habana. The 92.8 percent of patients with a clinical diagnosis of leukoplakia buccalis had slight epithelial dysplasia, from these and according to its grade of severity, there was found a slight epithelial dysplasia in the 53.0 percent, moderate epithelial dysplasia in the 36.4 percent and a severe epithelial dysplasia in 10.4 percent. The parakeratosis was manifested in the 43.9 percent associated with a slight epithelial dysplasia, 78.6 percent with a moderate dysplasia and in the 100 percent with the severe one. The epithelial dysplasia was present in the 57.1 percent of cases and the inflammatory infiltrate in the 79.2 percent of study samples. Authors conclude that in the study sample of leukoplakia buccalis there is a high percentage of epithelial dysplasia with predominance of its slight degree and a association between its severity degree with the different patterns of keratinization and the intensity of inflammatory infiltrate, something important in the analysis of its course in face a determined diagnosis y its prognosis.

Evaluación del desempeño de los conjugados anti-CD4/FITC y anti-CD8/FITC producidos en LABEX / Evaluation of the acting of conjugates anti-cd4/fitc and anti-cd8/fitc produced by LABEX

El desarrollo tecnológico de la conjugación de los anticuerpos monoclonales con diferentes fluorocromos garantiza disponer de nuevas herramientas para diagnosticar, evaluar y seguir clínicamente a pacientes con VIH/SIDA, cuyo control evolutivo actual se realiza teniendo en cuenta la carga viral y las subpoblaciones de linfocitos T CD4+. Los anticuerpos que reconocen el receptor CD4, son considerados como uno de los más potentes marcadores predictivos para la evaluación evolutiva del VIH/SIDA, además de ser uno de los criterios para el inicio y seguimiento del tratamiento antirretroviral. La cuantificación de linfocitos T CD8+ también representa una herramienta útil, pues ofrece información complementaria sobre la respuesta inmune inmediata en el proceso defensivo de las personas viviendo con VIH/SIDA. Tomando en consideración las regulaciones vigentes en la República de Cuba para la producción de diagnosticadores, se evaluó la acción de 2 reactivos basados en anticuerpos primarios conjugados con fluoresceína, anti-CD4 y anti-CD8, en muestras de individuos supuestamente sanos y de pacientes en diferentes fases de infección vírica. No se observaron diferencias significativas entre los valores de reconocimiento para ambas muestras con los reactivos evaluados (producidos en LABEX) y los controles comerciales utilizados de la firma DAKO, lo cual permite recomendar su uso en el diagnóstico, la evaluación y el seguimiento de los afectados por VIH/SIDA

Estabilidad del producto hemoclasificador Hemo-CIM® Anti-B: Evaluación durante 2 años / Stability of the Anti-B Hemo-CIM® hemoclassifier product: A 2-year evaluation

Los estudios de estabilidad de los reactivos frabricados a partir de anticuerpos monoclonales de origen murino, permiten establecer adecuadamente la vida de estos productos, y su realización constituye un requisito indispensable en el cumplimiento de las buenas prácticas de producción. Se usaron los métodos de hemaglutinación para medir la actividad biológica del producto Hemo-CIM® Anti-B expresada en la potencia, la avidez y la intensidad, frente a un panel de eritrocitos del grupo B y A1B, para demostrar más efectivamente cualquier deterioro del reactivo. Se estableció que la vida útil del hemoclasificador producido en el Centro de Inmunología Molecular es de 2 años con una temperatura de almacenamiento entre 2 y 8 oC. La evaluación que simula las condiciones a la que los usuarios someten a estos reactivos, demostró que el reactivo mantiene las características de calidad que se requieren para su uso. La estabilidad lograda con el Hemo-CIM® Anti-B es similar a la informada con el producto hemoclasificador monoclonal murino Hemo-CIM® Anti-A.

The stability studies of the reagents made from monoclonal antibodies of murine origin allow to establish the life of these products adequately and are an indispensable requisite for the fulfillment of the good practices of production. The hemagglutination methods were used to measure the biological activity of the Anti-B Hemo-CIMâ product expressed in the potency, avidity and intensity against a panel of erythrocytes of the group B and A1B in order to show in a more effective way any deterioration of the reagent. It was established that the useful life of the hemoclassifier produced at the Center of Mollecular Biology is of 2 years at a storage temperature between 2 and 8ºC. The evaluation that simulates the conditions to which the users subject these reagents showed that the reagent maintains the quality characteristics required for its use. The stability attained with the Anti-B Hemo-CIMâ is similiar to that reported with the murine monoclonal Anti-A Hemo-CIMâ hemoclassifier product.

Sistema analítico de evaluación de la actividad biológica del reactivo hemoclasificador HEMO-CIM ANTI-A / Analytical system of evaluation of the biological activity of anti-A hemo-cim hemoclassifier reagent

Con el objetivo de llevar a cabo el escalado industrial de los productos hemoclasificadores a partir de anticuerpos monoclonales murinos, se realizaron diversas actividades para crear las condiciones que permitieran su manufactura con el cumplimiento de las buenas prácticas de producción en el Centro de Inmunología Molecular. Se introdujeron los métodos analíticos para determinar la calidad del producto hemoclasificador Hemo-CIM anti-A en el Departamento de Control de la Calidad, se entrenó al personal responsable de esta actividad en el uso de estos métodos de evaluación de la actividad biológica del AcM anti-A en el sobrenadante, líquido ascítico y producto terminado; se diseñaron y elaboraron los documentos que forman parte del sistema de documentación; entre ellos, los procedimientos normalizados de operación (PNO), los expedientes maestros de lotes, los documentos para la recolección de datos, así como los registros de lote, los certificados de calidad y los registros de las mediciones de la actividad biológica para archivar los resultados en el laboratorio.

With the objective of carrying out industrial scaling of hemoclassifier products from murin monoclonal antibodies, a number of activities were performed to create the conditions for their manufacture in compliance with good manufacturing practices of the Molecular Immunology Center. The analytical methods were introduced to determine the quality of anti-A Hemo-CIM hemoclassifier in the Quality Assurance Department. Staff responsible for this work was trained in the use of these evaluation methods of the biological action of anti-A monoclonal antibody in supernatant, ascitic fluid and finished product; the documents that are part of the documentation system were designed and prepared, among them standard operating procedures, master production batch records, documents for data-gathering, batch records, quality certificates and biological activity measurement registers to file lab results.

Reactivo hemoclasificador monoclonal cubano Hemo-Cim anti-A. Estudio de estabilidad / Cuba anti-A Hemo-Cim hemoclassifier monoclonal reagent. Stability study

Los estudios de estabilidad de los reactivos fabricados a partir de anticuerpos monoclonales (AcM) de origen murino, son esenciales para obtener resultados adecuados en su aplicación práctica y constituyen un requisito indispensable en las buenas prácticas de producción, lo que permite establecer adecuadamente la vida de estos productos. Se usaron los métodos de hemaglutinación recomendados para medir la actividad biológica del producto Hemo-CIM anti-A expresada en la potencia, la avidez y la intensidad frente a un panel de eritrocitos del grupo A1 y A2B, que se incluyó por su baja expresión del antígeno A para demostrar más efectivamente cualquier deterioro que sufriera el reactivo. Se estableció que la vida útil del reactivo hemoclasificador producido en el Centro de Inmunología Molecular es de 2 años y se determinó que la temperatura de almacenamiento del producto está entre 2 y 8 ºC. Además, los lotes que se colocaron diariamente en la meseta de trabajo durante 5 horas a 21 ºC a partir del mes 0 y a los 8, 14 y 22 meses después de su producción, simulando las condiciones a la que los usuarios someten a estos reactivos, mantuvieron las características de calidad que se requieren para su uso, lo que demostró que con este producto se puede trabajar en esas condiciones

Ensayo de terreno de los rectivos hemoclasificadores monoclonales HEMO-CIM anti-A y HEMO-CIM anti-B como productos terminados / Field assay of HEMO-CIM anti-A and HEMO-CIM anti-B monoclonal hemoclassifying reactives as finished products

En Cuba, el registro sanitario de los diagnosticadores está regulado por normas estatales y en el caso de los reactivos hemoclasificadores se exige el ensayo de terreno en comparación con productos similares de calidad reconocida. Se evaluaron los productos terminados Hemo-CIM anti-A y anti-B elaborados en el Centro de Inmunología Molecular/CIMAB S.A., La Habana, en paralelo con los sueros policlonales humanos (MediCuba, La Habana) y con reactivos monoclonales equivalentes (Biotest AG, RFA), mediante un estudio multicéntrico en un servicio de transfusiones, 2 bancos de sangre provinciales y 2 municipales, con 1 130 muestras de sangre, de ellas 202 seleccionadas según criterios específicos de inclusión, por los métodos de hemaglutinación en láminas portaobjeto y centrifugación en tubos. Se encontró una especificidad diagnóstica del 100 porciento y una sensibilidad siempre superior al 99,5 porciento para ambos reactivos. Las opiniones de los posibles clientes sobre calidad, presentación y utilidad de los productos fueron satisfactorias

Inmunorreacción de los anticuerpos monoclonales A3, E1 y P3 en tejido normal / Immunoreaction of the monoclonal antibodies A3, E1 and P3 in normal tissue

Conocer el reconocimiento tisular en órganos normales de estos anticuerpos monoclonales (AcMs) dirigidos contra moléculas de gangliósidos es importante como parte de su evaluación para uso diagnóstico. Las muestras fueron procesadas frescas y posteriormente fijadas en paraformaldehído. Los 3 sobrenadantes de cultivo se trabajaron puros y en todos los experimentos se utilizaron controles negativos y positivos. Los 3 AcMs reaccionaron con células del epitelio intestinal y el tejido conectivo de la submucosa. Los antígenos A3 y E1 se localizaron también en el epitelio traqueobronquial. El AcM E1 reaccionó con los epitelios renal y prostático que el A3 lo hizo en la epidermis y los ganglios autónomos mientéricos. La inmunotinción de las secreciones renales e intestinales con estos AcMs junto a las características del marcaje tisular pudieron sugerir la naturaleza de estos antígenos

Expresión del antígeno HLA-DR1 en el infiltrado inflamatorio de carcinomas de piel y su relación con linfocitos T / Expression of HLA-DR1 antigen in skin carcinomas and its relation with T-Lymphocytes

Se empleó un método inmunohistoenzimático anticuerpos monoclonales IOR para estudiar in situ la expresión del antígeno HLA-DR1 en el infiltrado inflamatorio de carcinomas de piel y relacionarlo con la presencia de linfocitos T en éste. Se clasificaron los casos según el informe de Anatomía Patológica en 50 carcinomas de células basales y 30 epidermoides. No se encontró diferencia significativa en la expresión de HLA-DR1 al comparar ambos carcinomas. Se encontró relación entre la cantidad de células que expresan HLA-DR1 y de linfocitos T CD6+, CD3+ y CD2+ en ambos tumores y la subpoblación CD4+ en el epidermoide. La cantidad de CD8+ resultó escasa en todos los casos

Estudio "in situ" de las poblaciones de celulas mononucleares en carcinomas de piel / \"In situ\" study of mononuclear cell populations in skin carcinoma

Se realizo un estudio inmunohistologico con anticuerpos monoclonales IOR y se identificaron las poblaciones de celulas mononucleares presentes en el infiltrado reaccional de los carcinomas basocelular y epidermoide de piel. Se comparo la composicion celular del infiltrado reacional entre estos carcinomas, se encontraron diferencias significativas en el comportamiento de lapoblacion de linfocitos T CD6+ y de monocitos y macrofagos. Por los resultados obtenidos se explica como pudieran influir en el comportamiento biologico de estos tumores

Estudio comparativo de las subpoblaciones de linfocitos T en carcinomas de la piel / Comparative studies of T lymphocyte subpopulations in skin carcinoma

Se estudiaron 50 carcinomas basocelulares y 30 epidermoides de piel empleando anticuerpos monoclonales IOR para identificar in situ las subpoblaciones de linfocitos T en el infiltrado reaccional de células mononucleares presentes en estos tumores. Se encontró de moderada a escasa cantidad de linfocitos T CD4+ en estos carcinomas, mientras que los CD8 + eran escasos en ambos. No se observó diferencia significativa en el comportamiento de las subpoblaciones de linfocitos T entre estos 2 tumores

Estudio inmunohistoquímico en rabdomiosarcoma / Immunohistochemical study in rhabdomyosarcoma

Se realizó el estudio inmunohistoquímico de 32 rabdomiosarcomas haciendo uso de diversos marcadores del tejido conectivo empleando la técnica de PAP, método que ofrece una mayor precisión en la caracterización morfológica de los tumores de origen mesenquimatoso, con el fin de brindar una información que contribuya a un mejor diagnóstico y clasificación de esta entidad estudiada. Se destaca la importancia de la desmina como un marcador que se expresa en estadios muy tempranos de la diferenciación en los tumores de origen muscular. Además se discute el origen de la variante histología del Rabdomiosarcoma pleomórfico a partir de una célula madre capaz de expresar los diferentes marcadores que identifican las estirpes celulares de los 4 tejidos básicos.