Development and characterization of a packaging cell line for pseudo-infectious yellow fever virus particle generation

Abstract INTRODUCTION: Pseudo-infectious yellow fever viral particles (YFV-PIVs) have been used to study vaccines and viral packaging. Here, we report the development of a packaging cell line, which expresses the YFV prM/E proteins. METHODS: HEK293 cells were transfected with YFV prM/E and C (84 nt) genes to generate HEK293-YFV-PrM/E-opt. The cells were evaluated for their ability to express the heterologous proteins and to package the replicon repYFV-17D-LucIRES, generating YFV-PIVs. RESULTS: The expression of prM/E proteins was confirmed, and the cell line trans-packaged the replicon for recovery of a reporter for the YFV-PIVs. CONCLUSIONS: HEK293-YFV-prM/E-opt trans-packaging capacity demonstrates its possible biotechnology application.

Use of homologous recombination in yeast to create chimeric bovine viral diarrhea virus cDNA clones

Abstract The open reading frame of a Brazilian bovine viral diarrhea virus (BVDV) strain, IBSP4ncp, was recombined with the untranslated regions of the reference NADL strain by homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae, resulting in chimeric full-length cDNA clones of BVDV (chi-NADL/IBSP4ncp#2 and chi-NADL/IBSP4ncp#3). The recombinant clones were successfully recovered, resulting in viable viruses, having the kinetics of replication, focus size, and morphology similar to those of the parental virus, IBSP4ncp. In addition, the chimeric viruses remained stable for at least 10 passages in cell culture, maintaining their replication efficiency unaltered. Nucleotide sequencing revealed a few point mutations; nevertheless, the phenotype of the rescued viruses was nearly identical to that of the parental virus in all experiments. Thus, genetic stability of the chimeric clones and their phenotypic similarity to the parental virus confirm the ability of the yeast-based homologous recombination to maintain characteristics of the parental virus from which the recombinant viruses were derived. The data also support possible use of the yeast system for the manipulation of the BVDV genome.

Full-length infectious clone of a low passage dengue virus serotype 2 from Brazil

Full-length dengue virus (DENV) cDNA clones are an invaluable tool for many studies, including those on the development of attenuated or chimeric vaccines and on host-virus interactions. Furthermore, the importance of low passage DENV infectious clones should be highlighted, as these may harbour critical and unique strain-specific viral components from field-circulating isolates. The successful construction of a functional Brazilian low passage DENV serotype 2 full-length clone through homologous recombination reported here supports the use of a strategy that has been shown to be highly useful by our group for the development of flavivirus infectious clones and replicons.

Desenvolvimento de sistemas de genética reversa para os vírus da doença de gumboro e influenza aviária através do uso de recombinação homóloga em levedura / Development of reverse genetics systems for infectious bursal disease virus and avian influenza by yeast-based homologous recombination

A Doença de Gumboro (DG) é uma doença imunossupressora comum em aves jovens infectadas pelo Vírus da Doença de Gumboro (Infectious Bursal Disease Vírus, IBDV), sendo responsável por perdas econômicas no setor avícola. O vírus influenza apresenta-se com um alto nível de mutação, o que resulta no surgimento de vírus imunologicamente distintos capazes de causar pandemias ou epidemias. Entende-se por sistema de genética reversa viral (SGRV) a geração/recuperação de vírus por meio da transfecção celular do cDNA viral clonado ou seu RNA viral transcrito in vitro. SGRV pode ser usado na elucidação dos mecanismos de replicação do influenza e IBDV, e aplicações biotecnológicas como desenvolvimento de vacinas. Diante desse levantado, objetivou-se a construção de dois SGRVs por recombinação homóloga em levedura (RHL): um para IBDV e outro para influenza aviária (IA). Para o SGRV do IBDV, IBDV foi isolado no Brasil, teve seu genoma amplificado e clonado por RHL no vetor pJG-CMV-HDR. Os clones foram transfectados em fibroblasto de embrião de galinha (FEG) e o vírus gerado (IC-IBDVBr) mostrou estabilidade gênica e fenótipo similar ao vírus parental. A geração e crescimento do IC-IBDVBr não foram possíveis em células Vero. Para o SGRV do IA, IA foi isolado no Brasil, seu genoma foi amplificado e clonado em pDrive/pGEM-T Easy e depois subclonado por RHL no vetor pJGCh2008. Os clones em pJG-Ch2008 responsáveis pela codificação das proteínas do complexo polimerase viral (CPV) foram transfectados simultaneamente em células Human Embryonic Kidney 293T com plasmídeos contendo o gene repórter red fluorescent protein ou Gaussia luciferase, ambos flanqueados pela untransleated region do influenza. A funcionalidade do CPV do IA foi verificada pela expressão de RFP e GLuc. A recuperação do IA em FEG pelos clones em pJG-Ch2008 não foi possível. A funcionalidade do CPV mais a integridade dos clones indicam que a recuperação do IA não foi possível provavelmente devido à eficiência da transfecção celular. A construção do SGRV para IBDV, o primeiro do mundo feito por RHL e o primeiro desenvolvido no Brasil, junto com os passos iniciais para a construção do primeiro SGRV para influenza feito por RHL e a consequente construção do CPV por essa tecnologia, disponibilizam ao país ferramentas capazes de contribuir no esclarecimento do ciclo replicativo de ambos os vírus, além de criar bases para o futuro desenvolvimento de vacinas e vetores virais.