Outbreak of bovine tick-borne disease on a riverside property in the Western Amazonia: Case report / Surto de tristeza parasitária bovina em propriedade ribeirinha na Amazônia Ocidental: Relato de caso

The objective was to report an outbreak of tick-borne disease (TBD) on riverside property in the Western Amazon. The death of 25 Nellore cattle was reported on a rural property on the banks of the Purus River, state of Acre. The producer observed animals with staggering walking, drop in productivity, weight loss and evolution to death in approximately 30 days. Fifteen animals from the same batch were selected for clinical evaluation and the ear tip was punctured for hemoparasite research, in addition to blood collection for hematological, biochemical and molecular evaluation. The main laboratory findings were leukocytosis, thrombocytopenia, hypoproteinemia, elevated creatine kinase and reduced urea, creatinine and albumin, as well as visualization of forms suggestive of Anaplasma spp. in 13.33% of the samples. Through PCR, 20% positivity was observed for Anaplasmamarginale and 53.33% for Babesia sp. Hematological and biochemical changes, although highly suggestive, may suffer changes from other factors not related to TBD. Therefore, the presumptive identification of the etiological agent in the blood or confirmatory by molecular methods is essential in the diagnosis. Depending on the stage of the disease, low parasitemia occurs, making it difficult to see hemoparasites in blood smears. The Babesia sp. was the main agent of the outbreak of TBD in the population evaluated, which, when associated with early clinical and laboratory diagnosis, results in adequate therapeutic direction and prophylactic measures, promoting a balance between host, agent and vector.

Objetivou-se relatar um surto de tristeza parasitária bovina (TPB) em propriedade ribeirinha na Amazônia Ocidental. Foi notificado o óbito de 25 bovinos da raça Nelore, em uma propriedade rural às margens do rio Purus, estado do Acre. O produtor observou animais com andar cambaleante, queda na produtividade, perda de peso e evolução ao óbito em aproximadamente 30 dias. Quinze animais do mesmo lote foram selecionados para avaliação clínica e foi procedida a punção a ponta de orelha para pesquisa de hemoparasitos, além da coleta de sangue para avaliação hematológica, bioquímica e molecular. Os principais achados laboratoriais foram anemia, leucocitose, trombocitopenia, hipoproteinemia, elevação da creatina quinase e redução de ureia, creatinina e albumina, além da visualização de formas sugestivas de Anaplasma spp. em 13,33% das amostras. Por meio da PCR, foi observado 20% de positividade para Anaplasma marginale e 53,33% para Babesia sp. As alterações hematológicas e bioquímicas, embora bastante sugestivas, podem sofrer alterações de outros fatores não relacionados à TPB. Por isso, a identificação presuntiva do agente etiológico no sangue ou confirmatória por métodos moleculares é essencial no diagnóstico. A depender da fase da doença, ocorre baixa parasitemia, dificultando a visualização de hemoparasitos em esfregaços sanguíneos. A Babesia sp. foi o principal agente do surto de TPB na população avaliada, que, quando associado ao diagnóstico clínico e laboratorial precoce, resulta no direcionamento terapêutico adequado e medidas profiláticas, promovendo uma relação de equilíbrio entre hospedeiro, agente e vetor.

Natural infection of Trypanosoma sp. in domestic sheep from Ecuador / Infecção natural do Trypanosoma sp. em ovelhas domésticas do Equador

Trypanosomosis in sheep is a hemoparasitic disease of worldwide interest due to its effects on the health of animals and the economic impact on producers, is caused by the protozoan Trypanosoma sp. In the present study, the occurrence of Trypanosoma sp. in sheep from the urban-rural area of the canton Salitre was determined, through an applied study with a qualitative descriptive prospective cross-sectional approach, carried out between October 1, 2019, and February 19, 2020. Blood samples were extracted from the jugular vein and analyzed by the blood smear method using the Giemsa and Diff-Quick staining techniques. Previously, in a first study realized between 2018 and 2019, 2 cases (2%) of Trypanosoma sp., 1 case of Babesia sp. (1%), and 4 cases of Anaplasma marginale (4%) were identified, but without the presence of symptoms of the disease. However, in this new research study, of 170 animals sampled from 5 herds and aged between 3 and 8 years, 34 (20%) were positive for Trypanosoma sp., 6 for Babesia sp. (3.52%) and 6 for A. marginale (3.52%) with coinfection between them. In this research, deteriorated clinical aspects and low hematological values were also determined in positive animals; besides of the total of positive cases, 25 presented symptoms of hemoparasitic disease, 3 sheep had abortions and 8 died. The results of this study showed that Trypanosoma sp. could already become an endemic parasitosis in sheep in the country, representing a serious problem of animal health.

A tripanossomose em ovinos é uma doença hemoparasitária de interesse mundial devido a seus efeitos sobre a saúde dos animais e o impacto econômico sobre os produtores, Esta doença é causada pelo protozoário Trypanosoma sp. No presente estudo, foi determinada a ocorrência de Trypanosoma sp. em ovelhas da área urbano-rural do Cantão Salitre, através de um estudo aplicado com uma abordagem transversal descritiva qualitativa prospectiva, realizado entre dia primeiro de outubro de 2019, à 19 de fevereiro de 2020. Amostras de sangue foram extraídas da veia jugular e analisadas pelo método de esfregaço de sangue usando as técnicas de coloração Giemsa e Diff-Quick. Anteriormente, em um primeiro estudo realizado entre 2018 e 2019, dois casos (2%) de Trypanosoma sp., foram identificados um caso de Babesia sp. (1%), e quatro casos de Anaplasma marginale (4%), mas sem a presença de sintomas da doença. Entretanto, neste novo estudo de pesquisa, de 170 animais amostrados de cinco rebanhos e com idades entre três e oito anos, 34 (20%) foram positivos para Trypanosoma sp., seis para Babesia sp. (3,52%) e seis para A. marginale (3,52%) com coinfecção entre eles. Nesta pesquisa, aspectos clínicos deteriorados e baixos valores hematológicos também foram determinados em animais positivos; além do total de casos positivos, 25 apresentaram sintomas de doença hemoparasítica, três ovelhas tiveram abortos e oito morreram. Os resultados deste estudo mostram que o Trypanosoma sp. já poderia se tornar uma parasitose endêmica em ovinos no país, representando um grave problema de saúde animal.

Chemoprophylaxis for babesiosis and anaplasmosis in cattle: case report / Quimioprofilaxia para babesiose e anaplasmose em bovinos: relato de caso

Abstract Cattle tick fever (CTF) causes significant economic losses in the livestock sector. The pathogenic action of the hemoparasites is associated with anemia, weight loss, abortion and reduced productivity, which result with animal death. Programs to prevent CTF involve several procedures, including immunization, chemoprophylaxis and use of ectoparasiticides, together with the vector control in the environment. The objective of this study was to report an acute outbreak of CTF in a group of 157 Hereford cattle from a farm without presence of the vector, that were moved to a farm in the same state with a high tick infestation (Rhipicephalus microplus). On the day before the transportation, the animals received a chemoprophylaxis with imidocarb dipropionate (3 mg/kg, SC), which was repeated 21 days after the first application. After 42 days, some animals showed signs compatible with CTF, which was confirmed through clinical examination, necropsy, histopathological and hemoparasitological analyses. The morbidity rate was 37.6% and the mortality rate was 24.8%. Calves that were recently weaned were the group most affected with the tick fever, morbidity (100% and mortality (73%). Chemoprophylaxis in association with use of ectoparasiticides was not sufficient to control the outbreak of the disease.

Resumo A "tristeza parasitária bovina" (TPB) gera importantes perdas econômicas na bovinocultura mundial. A ação patogênica dos hemoparasitas resulta em anemia, perda de peso, abortos e diminuição da produtividade, culminando, muitas vezes, em óbito dos animais. Um programa de prevenção para TPB necessita de medidas integradas, como a imunização, quimioprofilaxia e utilização de ectoparasiticidas, em conjunto com ações que visem ao controle ambiental dos vetores. Este artigo tem em vista o relato de um surto de TPB em uma fazenda de produção de bovinos de corte e com alta infestação do carrapato (Rhipicephalus microplus). A fazenda adquiriu 157 animais puros de origem, da raça Hereford, proveniente de uma fazenda sem presença do vetor. No dia anterior ao transporte, os animais receberam quimioprofilaxia com dipropionato de imidocarb (3mg/Kg/SC), repetindo-se 21 dias após a primeira aplicação. Aos 42 dias, alguns bezerros manifestaram sinais clínicos compatíveis com TPB, sendo confirmado pelo exame clínico, necropsia, análises histopatológicas e hemoparasitológicas. A morbidade foi de 37,6% (59/157), e a letalidade de 24,8% (39/157). A categoria de bezerros recém desmamados foi a mais acometida, com morbidade de 100% (52/52) e letalidade de 73% (38/52). A quimioprofilaxia associada à utilização de ectoparasiticidas foram insuficientes para evitar a ocorrência do surto da enfermidade.

Characterization of cattle tick fever in calves from the northwestern region of Minas Gerais, Brazil / Caracterização do complexo da Tristeza Parasitária Bovina em bezerros da região noroeste de Minas Gerais, Brasil

Abstract The present study aimed to characterize the importance of the Anaplasma marginale, Babesia bovis and Babesia bigemina in the genesis of cattle tick fever (CTF) among dairy calves in the northwest of Minas Gerais, Brazil. Blood samples from 300 calves were collected, followed by DNA extraction and nested PCR using oligonucleotide primers to amplify fragments of the semi-nested for the msp5 gene (A. marginale), sbp-4 (B. bovis) and rap-1a (B. bigemina) Among the examined calves, the prevalence of A. marginale was 55.6% (n=167/300), B. bovis was 4.0% (n=12/300) and B. bigemina was 15.3% (n=46/300), by PCR techniques. Parasitic forms of A. marginale and B. bigemina were found in 36,3% and 2,6% of the blood smears while B. bovis was not detected. There was a statistical difference between the positivity of infected animals in the age groups 1 (10-70 days) and (>70-300 days) for A. marginale and B. bigemina. A total of 15 calves with the classic symptoms of disease were examined, and the samples obtained were confirmed as a simple infection by A. marginale through semi-nested PCR. These results confirm bovine anaplasmosis as the primary cause of CTF among the calves of dairy cattle within the studied area.

Resumo O presente estudo teve como objetivo caracterizar a importância de Anaplasma marginale, Babesia bigemina e Babesia bovis na gênese da tristeza parasitária bovina em bezerros leiteiros do noroeste de Minas Gerais. Foram coletadas 300 amostras sanguíneas de bezerros, seguidas por extração de DNA e Nested- PCR utilizando oligonucleotídeos iniciadores que amplificam fragmentos dos genes sbp-4 (B. bovis) e rap-1a (B. bigemina) e a Semi-Nested para o gene msp5 (A. marginale). A prevalência de A. marginale foi 55,66% (167/300), B. bigemina, 15,33% (46/300) e B. bovis 4,0% (12/300) dos bezerros examinados. Formas parasitárias de A. marginale and B. bigemina foram encontradas em 36,33% e 2,66% dos esfregaços sanguíneos, enquanto B. bovis não foi detectado. Houve diferença estatística entre as prevalências de animais infectados nas faixas etárias 1 (10-70 dias) e 2 (>70-300 dias). Um total de 15 animais com sintomas clássicos da doença foram examinados, e as amostras foram confirmadas como uma infecção simples por A. marginale através da Nested-PCR. Esses resultados confirmam a anaplasmose bovina como a principal agente da tristeza parasitária bovina nos bezerros do rebanho estudado.

Bovine babesiosis and anaplasmosis complex: diagnosis and evaluation of the risk factors from Bahia, Brazil / Complexo tristeza parasitária bovina: diagnóstico e avaliação dos fatores de risco na Bahia, Brasil

Direct diagnoses were made by using - blood smears and nested PCR (nPCR) tests on 309 blood samples from crossbred dairy cattle in the municipality of Ibicaraí, Bahia. From diagnostic blood smear slides, the observed parasitic frequencies were 31.1% for Anaplasma marginale and 20.4% for Babesia sp. From nPCR diagnoses, they were 63% for A. marginale, 34% for Babesia bigemina and 20.4% for Babesia bovis. There were significant differences (P <0.01) between the two diagnostic methods (nPCR and blood smear slides). The compliance obtained from the kappa test was 0.41 and 0.48 for A. marginale and Babesia sp., respectively. The tick samples from the six farms analyzed using nPCR were only positive for A. marginale. Evaluation of the risk factors relating to the presence of ticks and the age of the animals showed that there was a significant association (P <0.01) with the frequency of animals infected with both pathogens. Therefore, under the conditions studied, nPCR proved to be a good tool for diagnosing the agents of the bovine babesiosis and anaplasmosis complex because of its sensitivity and specificity in comparison with blood smears. The municipality of Ibicaraí is an area with endemic prevalence of bovine babesiosis and anaplasmosis confirmed by nPCR and A. marginale is the main agent of the disease.

Realizou-se o diagnóstico direto por esfregaço sanguíneo e nested PCR (nPCR) em 309 amostras de sangue de bovinos mestiços leiteiros provenientes do município de Ibicaraí, Bahia. A frequência observada no diagnóstico por lâminas de esfregaço sanguíneo foi 31,1% para Anaplasma marginale e 20,4% para Babesia sp. Enquanto que no diagnóstico por nPCR foi 63% para A. marginale, 34% para Babesia bigemina e 20,4% Babesia bovis. Verificaram-se diferenças significativas (P<0,01) na comparação entre os dois métodos de diagnósticos (nPCR e esfregaço sanguíneo). A concordância ao teste KAPPA obtida foi de 0,41 e 0,48 para A. marginale e Babesia sp., respectivamente. As amostras de carrapatos das seis propriedades analisadas por nPCR foram positivas apenas para A. marginale. Na avaliação dos fatores de risco verificou-se que a presença de carrapato e idade dos animais apresentaram associação significativa (P<0,01) com a frequência de animais infectados por ambos os patógenos analisados por nPCR. Portanto, nas condições estudadas, a nPCR revelou-se uma boa ferramenta para diagnóstico dos agentes do complexo tristeza parasitária bovina (TPB) devido a sensibilidade e especificidade, quando comparado ao esfregaço sanguíneo. O município de Ibicaraí apresenta-se como uma área endêmica para TPB com prevalência comprovada através de nPCR e, A. marginale o principal agente encontrado.

Detecção sorológica e molecular de Anaplasma marginale em búfalos na Ilha de Marajó, Pará / Serological and molecular detection of Anaplasma marginale in water buffaloes on Marajó Island, State of Pará, Brazil

O objetivo do estudo foi testar a prevalência sorológica e molecular de Anaplasma marginale em búfalos do municipio de Soure, Ilha de Marajó, estado do Pará, Brasil. Para a pesquisa sorologica foram selecionados randomicamente 800 animais e para a pesquisa molecular 50 destes animais foram aleatoriamente escolhidos. Para quantificar a prevalência sorológica utilizou-se o ensaio de imunoadsorção enzimático indireto (iELISA) com antígeno total contendo proteínas de superfície externa e para quantificar a prevalência molecular utilizou-se a reação em cadeia da polimerase (PCR), envolvendo a amplificação de fragmento gênico da proteína de superfície maior 5 (MSP5). A prevalência de animais positivos no ELISA para A. marginale foi de 25% (200/800). Na PCR foi detectada a presença de A. marginale em 2% (1/50) dos animais. Embora apenas um animal tenha sido positivo na PCR, observou-se que o mesmo foi negativo no ELISA. A presença do agente, mesmo em baixa prevalência, mostra que os bubalinos podem funcionar como um importante reservatório desse patógeno para os rebanhos bovinos da região norte do Brasil.

The aim of the study was to test the molecular and serological prevalence of Anaplasma marginale in water buffaloes of the Marajó Island, State of Pará, Brazil. For serologic research were randomly selected 800 buffaloes and for molecular research 50 of these animals were randomly chosen. To quantify the serological prevalence we used the indirect enzyme linked immunosorbent assay (iELISA) with total antigen containing proteins outer surface. To quantify the prevalence molecular was used the polymerase chain reaction (PCR) involving gene amplification fragment larger surface protein 5 (MSP5). The prevalence of positive animals in iELISA was 25% (200/800). In the PCR we detected the presence of A. marginale in 2% (1/50) of animals. Although only one animal was positive in PCR, we found that it was negative in ELISA. The presence of the agent, even in low prevalence, shows that buffaloes can act as an important reservoir for transmission of the pathogen to cattle in northern Brazil.

Diagnóstico molecular de Anaplasma marginale em bovinos: avaliação quantitativa de uma PCR em tempo real baseada no gene msp5 / Molecular diagnosis of Anaplasma marginale in cattle: quantitative evaluation of a real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) based on msp5 gene

The rickettsia Anaplasma marginale is considered the main agent of bovine anaplasmosis. Due the nonspecific clinical signs of the anaplasmosis, the diagnosis of infection depends of laboratory confirmation. In recent years, molecular diagnostic methods have been used to detect A. marginale in cattle. However, the existence of a large number of assays of different sensitivity and cost makes the choice of an appropriate test difficult. In the present study, a real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) based on the msp5 target gene was quantitatively assessed and compared to an end point PCR. Both reactions were subjected to sensitivity and specificity evaluation using plasmid DNA and samples from cattle experimentally infected with A. marginale. A comparative field trial of the tests was carried out using samples of cattle from a stable enzootic area for A. marginale. The real-time PCR showed a higher sensitivity than the end point PCR. This reaction (i.e. real-time PCR) was able to detect one copy of the msp5 gene in 100 ηg of plasmidial DNA, and more than 80% of its results were positive among experimentally infected animals seven days after infection. In addition, based on in silico analysis, the real-time PCR evaluated in the present study appears to be useful for the detection of A. ovis.

A riquétsia Anaplasma marginale é considerada o principal agente da anaplasmose bovina. Devido a não especificidade dos sinais clínicos, a confirmação da infecção nos animais depende de testes laboratoriais. Recentemente, métodos de diagnóstico molecular têm sido aplicados para detecção de A. marginale em bovinos. No entanto, a grande quantidade de testes com diferentes sensibilidade e custos tem dificultado a escolha do ensaio mais adequado. No presente estudo, uma PCR em tempo real baseada no gene msp5 foi avaliada quantitativamente e comparada a uma reação de PCR convencional. As reações foram submetidas à avaliação de sensibilidade e especificidade com DNA plasmidial e amostras provenientes de bovinos experimentalmente infectados por A. marginale. Uma avaliação comparativa a campo foi realizada entre os testes utilizando amostras provenientes de bovinos criados em uma região de estabilidade enzoótica para A. marginale. Embora os testes não tenham apresentado diferença estatisticamente significativa, a PCR em tempo real apresentou valor de sensibilidade maior do que a PCR convencional. A PCR em tempo real foi capaz de detectar uma cópia de msp5 em 100ng de DNA plasmidial, e mais de 80% de resultados positivos entre bovinos experimentalmente infectados apenas sete dias após infecção. Além disso, baseado em análise in silico, a PCR em tempo real avaliada aqui pode ser útil para detecção de Anaplasma ovis.

Development and assessment of a latex agglutination test based on recombinant MSP5 to detect antibodies against Anaplasma marginale in cattle

The recombinant protein MSP5 has been established as an important antigen for serological diagnosis of Anaplasma marginale by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, due to the high cost of specialized equipment, this technique is not accessible to all laboratories, especially in developing countries in areas where the disease is endemic. The present study describes the standardization of a latex agglutination test (LAT) to detect antibodies against A. marginale based on recombinant MSP5. Compared with indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA), the relative sensitivity and specificity of the LAT were 95.21% and 91.86% respectively, with an almost perfect agreement between tests (kappa index = 0.863). These results can be considered important for the serological diagnosis of A. marginale, as they indicate that the test represents a rapid and low cost alternative to ELISA.

Transplacental transmission of Anaplasma marginale in beef cattle chronically infected in southern Brazil / Transmissão transplacentária de Anaplasma marginale em bovinos de corte cronicamente infectados no sul do Brasil

In this study, we have investigated the incidence of transplacental transmission of Anaplasma marginale in chronically infected cows with no history of acute anaplasmosis during gestation. In addition, we evaluated various techniques for detection of transplacental transmission of A. marginale. Blood samples were collected from 30 cows at three different periods: at the time of artificial insemination, at gestational diagnosis, and after calving. Also, blood was collected from the newborn calves, including one sample before colostrum intake, and another three days after birth. A. marginale-specific antibodies were detected in 100% of the cows with an indirect fluorescent antibody test (IFAT), and in 97% of them, using an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Also, we observed that all of the three-day-old newborn calves were seropositive by IFAT. According to polymerase chain reaction, 63.3% of the cows were carriers of A. marginale, as well as 6.7% of the newborn calves. This represented a transplacental transmission rate of 10.5%. Furthermore, a correlation of 93.3% was observed between the two serodiagnostic techniques, demonstrating that both ELISA and IFAT can be used in epidemiological surveys of A. marginale. These results confirm the occurrence of transplacental transmission of A. marginale in chronically infected cows and suggest the importance of this transmission route in areas of enzootic instability.

O objetivo do estudo foi avaliar a transmissão transplacentária de A. marginale em bovinos de corte cronicamente infectados utilizando diferentes testes de diagnóstico. Amostras de sangue foram colhidas de trinta matrizes durante o período de inseminação artificial, no diagnóstico de gestação e após o parto. Foi colhido sangue dos bezerros antes da ingestão do colostro e três dias após o nascimento. Anticorpos foram detectados em 100% das matrizes pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e 97% pelo Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto (ELISA). Aos três dias de idade 100% dos bezerros estavam soropositivos na RIFI. Conforme os resultados da PCR, 63.3% das matrizes e 6.7% dos bezerros eram portadores do agente, representando taxa de transmissão transplacentária de 10.5%. Correlação de 93.3% foi observada entre os resultados das técnicas sorológicas, demonstrando que tanto ELISA quanto RIFI podem ser utilizadas em levantamentos epidemiológicos do agente. Os resultados confirmaram a transmissão transplacentária do agente em vacas cronicamente infectadas. Isto demonstra a importãncia desta via de transmissão do A. marginale em áreas de instabilidade enzoótica.

Occurrence of Ehrlichia canis and Anaplasma platys in household dogs from northern Parana / Ocorrência de Ehrlichia canis e Anaplasma platys em cães domiciliados da região norte do Paraná

Canine monocytic ehrlichiosis caused primarily by Ehrlichia canis and canine thrombocytic anaplasmosis induced by Anaplasma platys are important emerging zoonotic tick-borne diseases of dogs. There is evidence that these pathogens can also affect humans. This study evaluated the presence of E. canis and A. platys in blood samples collected from 256 domiciled dogs in the municipality of Jataizinho, located in north region of the State of Parana, Brazil, by PCR assay. The occurrence of E. canis and A. platys was 16.4% (42/256) and 19.4% (49/256), respectively; while 5.47% (14/256) of the dogs evaluated were co-infected by these two organisms. The presence of E. canis and A. platys was not significantly associated with the variables evaluated (sex, age, outdoor access, and presence of ticks during blood collection). Infection of dogs by E. canis was associated with anemia and thrombocytopenia, while infection induced by A. platys was related only to thrombocytopenia. Canine monocytic ehrlichiosis and canine thrombocytic anaplasmosis should be included in the differential diagnoses when these hematological alterations are observed during routine laboratory evaluation of dogs.(AU)

Erliquiose monocítica canina, causada principalmente por Ehrlichia canis, e anaplasmose trombocítica canina, devida a infecção com Anaplasma platys, são importantes doenças transmitidas por carrapatos que acometem os cães, com evidências que podem também acometer o homem. O presente estudo avaliou a ocorrência desses agentes em amostras de sangue de 256 cães domiciliados na cidade de Jataizinho, na região Norte do Paraná, Brasil, utilizando a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A ocorrência de E. canis e A. platys foi de 16,4% (42/256) e 19,4% (49/256), respectivamente, com 5,47% (14/256) dos animais apresentando coinfecção. Não foi observada associação significativa com as variáveis sexo, idade, acesso à rua e presença de carrapatos no momento da coleta de sangue. A infecção por E. canis teve relação com anemia e com trombocitopenia, enquanto a infecção por A. platys apresentou relação apenas com trombocitopenia. Com base nos resultados obtidos, reforçou-se a necessidade de que erliquiose e anaplasmose canina devem estar entre os diagnósticos diferenciais, quando da detecção de anemia e trombocitopenia em exames laboratoriais.(AU)

Investigação molecular de Ehrlichia spp. e Anaplasma platys em felinos domésticos: alterações clínicas, hematológicas e bioquímicas / Molecular investigation of Ehrlichia spp. and Anaplasma platys in domestic cats: clinical signs, hematological and biochemical alterations

Ehrlichia sp. e Anaplasma platys são micro-organismos Gram negativos, parasitos intracelulares obrigatórios, residindo em vacúolos citoplasmáticos de leucócitos e plaquetas, encontrados no sangue periférico ou em tecidos. Poucos relatos têm sido feitos sobre erliquiose e anaplasmose em gatos no Brasil, os quais são baseados na presença de mórulas em leucócitos e plaquetas, ou pela detecção de anticorpos. O objetivo deste trabalho foi investigar a infecção natural por Ehrlichia sp. e A.platys em gatos no Município de Campos dos Goytacazes-RJ, através da hematoscopia e pela detecção do DNA desses agentes. Foram utilizadas amostras de sangue total e de soro de 91 gatos, independente de raça, sexo e idade. Realizaram-se hemograma, bioquímica sérica e PCR, utilizando oligonucleotídes para Ehrlichia sp. e A.platys. Os dados de hematoscopia mostraram que 9,89 por cento dos gatos apresentaram mórulas em macroplaquetas. O DNA de A.platys foi detectado em 13,18 por cento dos 91 animais e em 44,44 por cento das amostras positivas à hematoscopia. O DNA de Ehrlichia sp. não foi detectado em nenhuma amostra. Nenhuma alteração foi observada nos sinais clínicos nem nos resultados laboratoriais nos animais estudados. Os dados sugerem que os felinos domésticos podem atuar como potenciais reservatórios para A. platys, como forma não sintomática das enfermidades relacionadas.

Ehrlichia sp. and Anaplasma platys are Gram-negative micro-organisms, obligate intracellular parasites, residing in cytoplasmic vacuoles of leukocytes and platelets, found in peripheral blood or tissue. Few reports have been made about ehrlichiosis and anaplasmosis in cats in Brazil, which are based on the presence of morulae in leukocytes and platelets, or by detecting antibodies. The objective of this study was to investigate the natural infection with Ehrlichia sp. and A. platys in cats in Campos dos Goytacazes-RJ, by hematoscopia and DNA detection of these agents. Samples of whole blood and serum from 91 cats, regardless of race, gender and age. Blood count, serum biochemistry and PCR using primers for Ehrlichia sp. and A. platys were perfomed. Data from hematoscopia showed 9.89 percent of morulae only in platelets. The DNA of A. platys was detected in 13.18 percent of the 91 samples and 44.44 percent of the positive at hematoscopia. The DNA of Ehrlichia sp. was not detected in any sample. All animals studied did not show clinical signs neither positive laboratory results. The data suggest that domestic cats can serve as potential reservoirs for A. platys as asymptomatic form of related diseases.

Serologic evidence of equine granulocytic anaplasmosis in horses from central West Brazil / Evidência sorológica de anaplasmose granulocítica equina em equinos do Centro-oeste Brasil

Ehrlichiosis is a zoonotic disease caused by gram-negative and intracellular obligatory bacterial organisms. Equine Granulocytic Anaplasmosis - EGA (formerly Equine Granulocytic Ehrlichiosis, EGE) is a seasonal disease, normally self-limited in horses. There are few reports in Brazil about this ehrlichial agent, as well as its natural vectors. Nowadays, veterinarians are considering the suspicion of EGA in horses with suggestive symptoms of ehrlichiosis and which do not respond to piroplasmosis treatment. The aim of the present study was to identify horses exposed to the agent A. phagocytophilum by serological and molecular techniques. Twenty equine blood and serum samples from the central West region of Brazil were evaluated by microscopic examination of buffy coat smear, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), indirect fluorescent antibody test (IFAT) and nested polymerase chain reaction (nPCR). Additionally, the serodiagnosis of Theileria equi by IFA and ELISA were carried out, as well as molecular diagnosis by nPCR. Thirteen (65 percent) serum samples were positive for A. phagocytophilum by ELISA, but none of them were positive by buffy-coat smear examination or nPCR. Antibodies IgG anti-T. equi were detected in 18 (90 percent) and 17 (85 percent) horses by IFA and ELISA, respectively and the agent was detected in 9 (45 percent) animals by nPCR. Our data may be considered as important information to understanding the occurrence of EGA and equine piroplasmosis in central West Brazil.

A Erliquiose é uma doença zoonótica causada por bactérias gram-negativas e intracelulares obrigatórias. A Anaplasmose Granulocítica Equina - AGE (anteriormente denominada Erliquiose Granulocítica Equina, EGE) é uma enfermidade sazonal, normalmente auto-limitante em equinos. No Brasil, existem poucos relatos deste agente erliquial, bem como de seus vetores naturais. Atualmente, veterinários têm levantado a suspeita de casos de AGE em equinos com sinais clínicos sugestivos de erliquiose e não responsivos ao tratamento para a piroplasmose equina. O objetivo do presente estudo foi identificar equinos expostos a A. phagocytophilum por meio de técnicas sorológicas e moleculares. Vinte amostras de sangue e soro de equinos da região Centro-oeste do Brasil foram avaliados por meio do exame microscópico de capa leucocitária, ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e reação em cadeia da polimerase (nested PCR). Adicionalmente, o diagnóstico sorológico de Theileria equi pela RIFI e ELISA foram realizados, assim como o diagnóstico molecular pelo nPCR. Treze (65 por cento) amostras de soro foram positivas para A. phagocytophilum pelo teste de ELISA, entretanto nenhum equino foi positivo pelo exame microscópico da capa leucocitária ou nPCR. Anticorpos IgG anti-T. equi foram detectados em 18 (90 por cento) e 17 (85 por cento) equinos pela RIFI e ELISA, respectivamente e o agente foi detectado em 9 (45 por cento) animais pelo nPCR. Estes dados sugerem importante informação para o entendimento da ocorrência da AGE e piroplasmose equina no Centro-oeste do Brasil.

Real time polymerase chain reaction to diagnose Anaplasma marginale in cattle and deer (Ozotoceros bezoarticus leucogaster) of the Brazilian Pantanal / Reação da polimerase em cadeia tempo real para diagnóstico de Anaplasma marginale em bovino e veado campeiro do Pantanal brasileiro Ozotoceros bezoarticus leucogaster

Epizootiological study of Anaplasma marginale in regions that contain various reservoir hosts, co-existence of rickettsia pathogens, and common vectors is a complicated task. To achieve diagnosis of this rickettsia in cattle and campeiro deer of Brazilian Pantanal, a comparison was made between a real time polymerase chain reaction (RT-PCR) with intercalating Sybr Green fluorochrome and primers based on msp5 gene of A. marginale; a conventional PCR (C-PCR); and parasitological examination using thin blood smear stained with Giemsa-MayGrunwald. Both PCRs showed good performance in the diagnosis of A. marginale in cattle, and were superior to the parasitological exam. The RT-PCR detected seven positive campeiro deer (16.3 percent). This rate was significantly higher compared to C-PCR, which identified one animal as positive (2.3 percent), and also compared to parasitological diagnosis, which did not find any positive animals. The dissociation temperature average of positive reactions in cattle (81.72 ºC ± 0.20) was identical to dissociation temperature found in the cervids (81.72 ºC ± 0.12), suggesting that both animal species were infected with A. marginale. We concluded that RT-PCR can be used for A. marginale diagnosis and in epizootiological studies of cattle and cervids; in spite of the small number of campeiro deer samples, the results indicated that this wildlife species has importance in the Anaplasma epizootiology in the Brazilian Pantanal.

O estudo epizootiológico de Anaplasma marginale em regiões que existem vários reservatórios, co-existência de espécies de riquétsias patógenas e vetores comuns é uma tarefa complicada. Com o objetivo de obter o diagnóstico dessa riquétsia em bovinos e veado campeiro do Pantanal brasileiro foi avaliada uma reação da polimerase em cadeia em tempo real (PCR-TR) com o fluoróforo intercalante de fita dupla de DNA Sybr Green e iniciadores baseados na seqüência do gene msp5 de A. marginale comparando-a a uma PCR convencional (PCR-C) e ao exame parasitológico de esfregaço fino de sangue corado com Giemsa-MayGrunwald. Ambas PCRs apresentaram bom desempenho no diagnóstico de A. marginale nos bovinos, o qual foi superior ao exame parasitológico. O PCR-TR detectou sete veados campeiros positivos (16,3 por cento), o que foi significativamente maior comparado ao PCR-C identificando um animal como positivo (2,3 por cento), e ao exame parasitológico não encontrou nenhum animal positivo. A média da temperatura de dissociação das reações positivas para amostras de bovinos (81,72 ºC ± 0,20) foi idêntica àquelas dos cervídeos ( 81,72 ºC ± 0,12), o que sugere que ambas espécies animais foram infectadas por A. marginale. Concluímos que PCR-TR pode ser utilizada para diagnóstico e estudos epizootiológicos de A. marginale em bovinos e cervídeos. Apesar da pequena amostragem de veado campeiro os resultados indicam que essa espécie de animal selvagem tem importância na epizootiologia do Anaplasma no Pantanal brasileiro.

Comparação de nested-PCR com o diagnóstico direto na detecção de Ehrlichia canis e Anaplasma platys em cães / Comparison of nested-PCR with blood smear examination in detection of Ehrlichia canis and Anaplasma platys in dogs

Os sinais clínicos das infecções por Ehrlichia canis e Anaplasma platys são similares, e o diagnóstico desses patógenos feito por esfregaços sanguíneos corados é difícil devido à sensibilidade e especificidade. Por outro lado, os diagnósticos moleculares são altamente sensíveis e específicos, e nested-PCRs têm sido otimizadas para o diagnóstico preciso desses patógenos em cães. Em um Hospital Veterinário Escola, amostras de sangue total com EDTA foram obtidas de 100 cães, e esfregaços foram feitos das amostras de sangue para busca dos parasitos intracelulares. Para cada amostra, DNA foi extraído e submetido à nPCR para detecção de E. canis e A. platys. Os resultados dos esfregaços sanguíneos mostraram que 9% dos animais foram positivos para E. canis e 21% para A. platys. Com relação à nPCR, 57 e 55% dos cães foram positivos para E. canis e A. platys, respectivamente. Quando comparados com a nPCR, os esfregaços sanguíneos corados revelaram resultados falso-negativos para E. canis e A. platys. Os resultados indicam que a nPCR é altamente sensível e específica para detecção de ambos os patógenos, e os diagnósticos moleculares podem ser mais úteis nos Hospitais Veterinários.

The clinical signs of Ehrlichia canis and Anaplasma platys infection are similar, and the diagnosis of these pathogens made by stained blood smears is poor due sensibility and specificity. On the other hand, the molecular diagnosis is highly sensitive and specific and nested-PCR have been optimized for accurate diagnosis these pathogens in dogs. At the veterinary teaching hospital, whole-blood samples with EDTA were obtained from 100 dogs and smears were made from blood samples for evaluation for intracellular parasites. For each sample, DNA was extracted and submitted to nPCR analysis for detection of E. canis and A. platys. The results of stained blood smears showed 9% of the animals were positive for E. canis and 21% for A. platys. Regarding of nPCR analysis, 57 and 55% of dogs were positive for E. canis and A. platys respectively. As compared to a nested PCR, the stained blood smears revealed false-negative results for both E. canis and A. platys. The results indicate that the nPCR is highly sensitive and specific for detection of both pathogens and the molecular diagnosis could be more useful at veterinary hospital.

Evidencia clínica y serológica de rickettsiosis canina en Chile / Clinical and serological evidence of canine rickettsiosis in Chile

En Chile, no se han documentado infecciones por Rickettsias en mascotas; algunas de ellas tienen importante potencial zoonótico. Objetivos: Reportar dos casos de rickettsiosis canina con confirmación serológica y determinar seroprevalencia de Rickettsia sp un grupo de caninos. Métodos: IgG anti-Rickettsia conorii y anti-Anaplasma phagocitophilum por IFI en dos caninos con cuadro clínico sugerente de rickettsiosis. Determinación de IgG anti-R. conorii en 77 caninos. Resultados: Como casos clínicos hubo un canino con fiebre, mialgias y melena y otro con manifestaciones he-morrágicas y compromiso neurológico. Seroprevalencia: 35% de los caninos presentaban IgG anti-Rickettsia. Discusión: Se reporta por primera vez en Chile la presencia de rickettsiosis canina, tanto clínica como serológica. Se documenta co-infección por Rickettsia y Anaplasma, dos agentes transmitidos por garrapatas. Es necesario realizar estudios de biología molecular para confirmar la especie de rickettsia presente en Chile. Además, debe estudiarse el rol zoonótico de estas infecciones en nuestro medio.

Rickettsial infections in pets have not been documented in Chile. Some of those infections have relevant zoonotic potential. Objectives: To report two serologically confirmed cases of canine rickettsiosis. To determine seroprevalence to Rickettsia sp in a group of dogs. Methods: IgG antibodies anti-R. conorii and anti-A. phagocitophilum by IFI in two dogs with clinical rickettsiosis. IgG antibodies anti-R. conorii in a group of 77 dogs. Results: Clinical cases: a dog presented with fever, myalgias and melena, another dog with bleeding and neurological involvement. Seroprevalence: 35% of the dogs had antibodies against Rickettsia. Discussion: This is the first evidence of canine rickettsiosis in Chile, both clinical and serological. Co-infection with two tickborne agents: Rickettsia and Anaplasma, is documented. Molecular studies are needed to confirm the rickettsial species present in Chile. The zoonotic role of these infections must be also studied.

Uveitis due to anaplasmosis in a newborn Holstein calf

Relata-se o caso de um bovino com, aproximadamente, seis horas de vida, apresentando histórico de febre, apatia, inapetência e desconforto ocular. No exame oftálmico rotineiro, encontraram-se valores do teste da lágrima de Schirmer aumentados, diminuição da pressão intra-ocular, hemorragia conjuntival, uveíte anterior, edema corneal e injeção ciliar em ambos os olhos. Coletou-se amostra de sangue para realização de esfregaço sangüíneo, hemograma e bioquímica sérica. No esfregaço visibilizaram-se corpúsculos de Anaplasma marginale em hemácias parasitadas. Quanto à bioquímica sérica, não foram observadas alterações. Os mesmos exames foram realizados na mãe do animal tendo como resultado a positividade para A. marginale. Para o controle da uveíte foi utilizada uma única aplicação de 0,5ml de betametasona a 5 por cento, por via subconjuntival, em cada um dos olhos. Para o tratamento da anaplasmose, seguiu-se o protocolo a base de 10mg/kg de oxitetraciclina, por via intramuscular profunda, a cada 12 horas. Diante os achados oftálmicos e a presença de corpúsculos de A. marginale em hemácias parasitadas, contatou-se, ser um caso de uveíte crônica secundaria a doença sistêmica, factível com Anaplasmose.

Comparison between indirect enzyme-linked immunosorbent assays for Anaplasma marginale antibodies with recombinant major surface protein 5 and initial body antigens

Indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) based on recombinant major surface protein 5 (rMSP5) and initial body (IB) antigens from a Brazilian isolate of Anaplasma marginale were developed to detect antibodies against this rickettsia in cattle. Both tests showed the same sensitivity (98.2 percent) and specificities (100 percent for rMSP5 and 93.8 percent for IB ELISA) which did not differ statistically. No cross-reactions were detected with Babesia bigemina antibodies, but 5 (rMSP5 ELISA) to 15 percent (IB ELISA) of cross-reactions were detected with B. bovis antibodies. However, such difference was not statistically significant. Prevalences of seropositive crossbred beef cattle raised extensively in Miranda county, state of Mato Grosso do Sul, Brazil, were 78.1 percent by rMSP5 ELISA and 79.7 percent by IB ELISA. In the analysis of sera from dairy calves naturally-infected with A. marginale, the dynamics of antibody production was very similar between both tests, with maternal antibodies reaching the lowest levels at 15-30 days, followed by an increase in the mean optical densities in both ELISAs, suggesting the development of active immunity against A. marginale. Results showed that all calves were seropositive by one-year old, characterizing a situation of enzootic stability. The similar performances of the ELISAs suggest that both tests can be used in epidemiological surveys for detection of antibodies to A. marginale in cattle.

Development of enzyme-linked immunosorbent assays based on recombinant MSP1a and MSP2 of Anaplasma marginale

Indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) based on recombinant MSP1a and MSP2 from a Brazilian isolate of Anaplasma marginale were developed to detect antibodies against this rickettsia in cattle. The high sensitivities (99 percent for both tests) and specificities (100 percent for both tests) were confirmed with sera from cattle positive or negative for A. marginale antibodies, respectively, by immunofluorescent antibody test. By the analysis of 583 sera from cattle of three regions of the state of Pernambuco, Brazil, the agreement between both tests was high, with a kappa index of 0.89. The similar performances of the ELISAs suggest that both tests can be used in epidemiological surveys for detection of antibodies to A. marginale in cattle.

Serological survey of Babesia bovis, Babesia bigemina, and Anaplasma marginale antibodies in cattle from the semi-arid region of the state of Bahia, Brazil, by enzyme-linked immunosorbent assays

The objectives of this work were to determine the prevalence of Babesia bovis, Babesia bigemina, and Anaplasma marginale detecting antibodies in cattle raised in the semi-arid region of the state of Bahia, Brazil, through indirect enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) and to compare the performances of indirect enzyme-linked immunosorbent assays with crude (I-ELISA-CrAnaAg) and recombinant major surface protein-5 (I-ELISA-MSP-5Ag), as antigens to detect antibodies against A. marginale. An stable enzootic area was found in Senhor do Bonfim and Euclides da Cunha for B. bovis that showed 86 and 95.5 percent of prevalence, respectively, and for B. bigemina with 90.8 and 91.3 percent. On the other hand, Uauá and Juazeiro, were characterized as enzootically unstable areas, since prevalences were: B. bovis - 63.7 and 56.4 percent and B. bigemina - 53 and 54.8 percent, respectively. The prevalence of A. marginale in the four municipalities was above 97 percent with I-ELISA-CrAnaAg and 94.8 percent with I-ELISA-MSP-5Ag which is an indication of stable enzootic condition for the rickettsia. The I-ELISA-CrAnaAg and I-ELISA-MSP-5Ag showed a highly significant association (r = 0.977), which means that both ELISA tests are suitable for epidemiological studies of A. marginale.