Papel do receptor B2 de cininas na terapia da neurodegeneração dopaminérgica em modelo animal / Targeting Kinin-B2 receptors for the treatment of dopaminergic neurodegeneration in an animal mode

A Doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo, caracterizada em parte pela perda de neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal, originada na substância negra com projeções para o estriado, causando vários déficits motores. Atualmente, o tratamento mais utilizado é a administração de L-DOPA, um análogo da dopamina. Porém, essa droga apresenta eficácia limitada e induz diversos efeitos colaterais. A exploração dos efeitos neuroprotetores, proliferativos e neuroregenerativos da bradicinina (BK) em modelo animal de DP pode conduzir à substituição celular do tecido lesionado pela 6-hidroxidopamina (6-OHDA). De fato, a BK e seus receptores possuem um grande espectro de ações fisiológicas, estando classicamente envolvida no controle da homeostase cardiovascular e inflamação, além de exercer efeitos protetores em fisiopatologias do sistema nervoso, como em modelos de acidente vascular cerebral. Vários tipos celulares têm suas vias de sinalização associadas à ativação do receptor B2 de cininas (B2BKR). Trabalhos anteriores de nosso grupo mostraram que a BK está envolvida na diferenciação neural de células progenitoras neurais por um loop autócrino que resulta em ativação do B2BKR. Os resultados apresentados neste trabalho mostram a eficácia do tratamento com BK, um agonista de B2BKR, em animais submetidos à lesão da via nigro-estriatal induzida por 6-OHDA. Além disso, há uma recuperação comportamental e histológica desses animais quando tratados com Captopril®, um potencializador dos efeitos farmacológicos da BK, e com [Phe8Ψ(CH-NH)Arg9]-Bradicinina, agonista estável do receptor B2BKR. Assim, concluímos que a ativação de B2BKR pela BK desencadeiaum processo de neuroregeneração dopaminérgica de animais submetidos à lesão por 6-OHDA. Trabalhos recentes mostram que o receptor B2BKR desempenha um importante papel neuroprotetor em modelo animal da Doença de Alzheimer, o que corrobora nossos achados. Juntos, esses resultados contribuem para o estabelecimento da ação neuroprotetora e neurorregenerativa da BK no modelo de animal de neurodegeneração dopaminérgica, tornando-a uma excelente candidata para aplicação em terapias de reparo neuronal

Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder partially characterized by the loss of dopaminergic neurons from the nigrostriatal pathway, originated in the substantia nigra with projections to the striatum, which causes several motor deficits. Currently, the most commonly used drug for PD treatment is levodopa. However, it has limited efficacy and induces several side effects. Elucidation of the neuroprotective, proliferative and neuroregenerative effects of bradykinin (BK) in animal models of PD can culminate in cellular replacement of the tissue damaged by 6-hydroxydopamine (6-OHDA). In fact, BK and its receptor have several physiological effects, being classically involved in the control of cardiovascular homeostasis and inflammation. Besides, BK exerts protective effects on nervous system pathophysiology, as observed in stroke models. Several cell types have their signaling pathways associated with the B2 kinin receptor (B2BKR) activation. Previous work from our group showed that BK is involved in differentiation of neural progenitor cells by an autocrine loop that results in activation of B2BKR. The results presented in this thesis show the efficacy of treatment with BK, through B2BKR activation, in animals submitted to nigrostriatal pathway injury induced by 6-OH dopamine. Furthermore, behavioral and histological recoveries of these animals were observed when treated with Captopril®, a potentiator of BK pharmacological effects, and with [Phe8Ψ (CH-NH) Arg9] -BK, a stable agonist of the B2BKR receptor. Thus, we conclude that BK activation of B2BKR triggers neuroregenerative processes in animals submitted to 6- OHDA injury. Recent studies showed that the B2BKR receptor plays an important neuroprotective role in an animal model of Alzheimer's disease, which corroboratesour findings. Together, these results contribute to the establishment of the neuroprotective and neuroregenerative actions of BK - an excellent candidate for neural repair therapies

Kinin B2-Receptor in human iPSC differentiation into cardiomyocytes / Receptor B2 de cininas na diferenciação de iPSC humanas em cardiomiócitos

Cardiovascular diseases are responsible for almost one third of all global deaths yearly, and therefore are largely studied. Cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) have emerged as an exciting technology for cardiac disease modelling and personalised therapy. Nevertheless, issues concerning functional and molecular maturation are still faced. In addition to this, differentiation protocols generally yield a heterogeneous mixed population comprised of nodal, atrial and ventricular-like subtypes, being unsuitable for therapeutic purposes. Bradykinin (BK) is a vasoactive peptide which exerts important physiological roles in the cardiovascular system, having been previously described as important for cellular, keratinocyte and skeletal muscle differentiation. This project performed in cooperation with PluriCell Biotech, a startup specialized in the production and differentiation of hiPSC-CM, has sought (1) characterizing gene and protein expression of molecular markers of maturation and of subtype specification throughout of differentiation; (2) Assessing the electrical functionality of hiPSC-CM through the characterization of subtype-specific action potentials (APs) and (3) Investigating whether the progress of hiPSCCM maturation is regulated by BK through kinin-B2 receptors (B2R). Our results have validated the model that proposes a developmental-dependent switch between skeletal (ssTnI) and cardiac (cTnI) isoforms of troponin I as differentiation progresses, at least to some extent. Furthermore, prolonged time in culture has resulted in higher levels of expression of the ventricular marker MLC2v and in increased rates of ventricular-like action APs. Electrophysiological analysis of hiPSC-CM reveals a mixed population with AP morphologies correspondent to nodal, atrial and ventricular subtypes, all showing pronounced automaticity as well as other features of immature cardiomyocytes, such as low amplitude and depolarization velocity. Such findings are coherent with those from other groups who have attempted to differentiate mature native-like cardiac cells from pluripotent stem cells sources, without fully succeeding. After showing that differentiating hiPSC-CM express a functional and responsive B2R, the receptor was subjected to chronic activation with 10µM BK and 1µM BK or inhibition with 5µM Firazyr+BK. Even though B2R modulation has not interfered negatively with differentiation yields nor cell morphology, analysis of gene andprotein expression of ssTnI or cTnI and of the ventricular marker MLC2v, have revealed no significant results in comparison to untreated controls. This suggests that BK does not interfere on hiPSC-CM maturation nor subtype specification, although we cannot rule out that it could be leading to other unexplored effects. We recommend a closer look into which intracellular signalling pathways become active upon B2R stimulation in hiPSC-CM, in order to narrow down cellular processes for further investigation

Doenças cardiovasculares são responsáveis por quase um terço de todas as mortes globais anualmente, e por isto o sistema cardiovascular é amplamente estudado. Cardiomiócitos derivados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCCM) emergiram como uma promissora tecnologia para modelagem de doenças cardíacas e terapia personalizada. No entanto, desafios acerca de sua maturação funcional e molecular ainda são enfrentados. Além disso, protocolos de diferenciação geralmente levam à obtenção de populações heterogêneas contendo células com fenótipos similares aos de cardiomiócitos nodais, atriais e ventriculares sendo, portanto, inapropriadas para fins terapêuticos. A bradicinina (BK) é um peptídio vasoativo que exerce importantes papeis fisiológicos no sistema cardiovascular, além de ter sido previamente descrita como importante para a diferenciação neuronal, de queratinócitos e de músculo esquelético. Este projeto foi realizado em colaboração com a empresa PluriCell Biotech, uma startup especializada na produção e diferenciação de hiPSC-CM, e buscou (1) caracterizar a expressão gênica e proteíca de marcadores moleculares de maturação e de especificação de subtipos cardíacos durante a diferenciação; (2) avaliar a funcionalidade elétrica de hiPSC-CM por meio da caracterização de seus potenciais de ação (PAs) e (3) Investigar se o progresso da diferenciação de hiPSCCM é regulado por bradicinina por meio do receptor B2 (B2R). Nossos resultados validaram o modelo que propõe um switch na expressão das isoformas funcionais de troponina I esquelética (ssTnI) e cardíaca (cTnI), durante o desenvolvimento e diferenciação celular, pelo menos parcialmente. Além disso, tempo prolongado em cultura resultou em maiores níveis de expressão do marcador ventricular MLC2v, assim como maiores frequências de PAs com morfologias similares a de cardiomiócitos ventriculares. Análise eletrofisiológica de hiPSCCM revelam a existência de uma população mista contendo PAs correspondentes aos subtipos nodais, atriais e ventriculares, assim como pronunciada automaticidade e outros atributos típicos de cardiomiócitos imaturos, como baixa amplitude e devagar velocidade de despolarização. Estes resultados são coerentes com os de outros grupos que ainda não foram totalmente bem-sucedidos em diferenciar células cardíacas maduras similares acardiomiócitos nativos a partir de células-troncos pluripotentes. Após mostrar que as hiPSCCM expressam receptores B2 funcionais e responsivos, submetemos o receptor a uma ativação crônica com BK 10µM e BK 1µM ou inibição crônica com Firazyr 5µM + BK. Apesar da modulação do B2R não ter interferido de forma negativa no rendimento da diferenciação ou na morfologia celular, análise de expressão gênica e proteica de ssTnI e cTnI e do marcador ventricular MLC2v não revelou resultados significativos em comparação aos controles não-tratados. Isto sugere que a BK não interfere na maturação e especificação de subtipos cardíacos em hiPSC-CM, apesar de não podermos ignorar o fato de que ela poderia estar desencadeando outros efeitos inexplorados. Nós recomendamos um estudo mais aprofundado acerca de quais vias de sinalização se tornam ativas após estimulação do receptor B2 em hiPSC-CM, com o objetivo de afunilar quais processos celulares poderiam ser investigados em uma próxima etapa deste estudo

Kn-Ba: a novel serine protease isolated from Bitis arietans snake venom with fibrinogenolytic and kinin-releasing activities

Bitis arietans is a venomous snake found in sub-Saharan Africa and in parts of Morocco and Saudi Arabia. The envenomation is characterized by local and systemic reactions including pain, blistering, edema and tissue damage, besides hemostatic and cardiovascular disturbances, which can cause death or permanent disabilities in its victims. However, the action mechanisms that provoke these effects remain poorly understood, especially the activities of purified venom components. Therefore, in order to elucidate the molecular mechanisms that make the Bitis arietans venom so potent and harmful to human beings, this study reports the isolation and biochemical characterization of a snake venom serine protease (SVSP). Methods: Solubilized venom was fractionated by molecular exclusion chromatography and the proteolytic activity was determined using fluorescent substrates. The peaks that showed serine protease activity were determined by blocking the proteolytic activity with site-directed inhibitors. In sequence, the fraction of interest was submitted to another cycle of molecular exclusion chromatography. The purified serine protease was identified by mass spectrometry and characterized biochemically and immunochemically. Results: A serine protease of 33 kDa with fibrinogen-degrading and kinin-releasing activities was isolated, described, and designated herein as Kn-Ba. The experimental Butantan Institute antivenom produced against Bitis arietans venom inhibited the Kn-Ba activity. Conclusions: The in vitro activities of Kn-Ba can be correlated with the capacity of the venom to provoke bleeding and clotting disorders as well as hypotension, which are common symptoms presented by envenomed victims. Obtaining satisfactory Kn-Ba inhibition through the experimental antivenom is important, given the WHO's recommendation of immunotherapy in cases of human accidents with venomous snakes.(AU)

Cardioprotective effect of ornitho-kinin in an anesthetized, open-chest chicken model of acute coronary occlusion

The generation of bradykinin (BK; Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) in blood and kallidin (Lys-BK) in tissues by the action of the kallikrein-kinin system has received little attention in non-mammalian vertebrates. In mammals, kallidin can be generated by the coronary endothelium and myocytes in response to ischemia, mediating cardioprotective events. The plasma of birds lacks two key components of the kallikrein-kinin system: the low molecular weight kininogen and a prekallikrein activator analogous to mammalian factor XII, but treatment with bovine plasma kallikrein generates ornitho-kinin [Thr6,Leu8]-BK. The possible cardioprotective effect of ornitho-kinin infusion was investigated in an anesthetized, open-chest chicken model of acute coronary occlusion. A branch of the left main coronary artery was reversibly ligated to produce ischemia followed by reperfusion, after which the degree of myocardial necrosis (infarct size as a percent of area at risk) was assessed by tetrazolium staining. The iv injection of a low dose of ornitho-kinin (4 µg/kg) reduced mean arterial pressure from 88 ± 12 to 42 ± 7 mmHg and increased heart rate from 335 ± 38 to 402 ± 45 bpm (N = 5). The size of the infarct was reduced by pretreatment with ornitho-kinin (500 µg/kg infused over a period of 5 min) from 35 ± 3 to 10 ± 2 percent of the area at risk. These results suggest that the physiological role of the kallikrein-kinin system is preserved in this animal model in spite of the absence of two key components, i.e., low molecular weight kininogen and factor XII.

Estudo da participação do sistema de cininas na patogenia da miocardite murina decorrente da infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi / Study of the participation of the kinin system on the pathogenesis of the murine cardiomyopathy following by the experimental Trypanosoma cruzi infection

Uma das principais patologias relacionadas à Doença de Chagas é a cardiopatia chagásica, sendo uma das principais causas de morte durante a fase aguda da infecção. A cardiopatia aguda difere da crônica, devido ao processo inflamatório intenso e a presença de ninhos de parasitas, diferente do processo fibrótico e praticamente ausência de parasitas, observando durante a fase crônica. As cininas são um grupo de proteínas vasoativas que apresentam uma relação estreita com a infectividade do Trypasonoma cruzi. Diversos autores descrevem a capacidade do T. cruzi em ativar o sistema de cininas e infectar células, sendo sua infectividade, potencializada, pela inibição da degradação dessas moléculas. Cininas podem induzir resistência à infecção pelo T. cruzi através da ativação de células dendríticas, pela via de sinalização dependente de B2R. Recentemente, foi demonstrado que camundongos tratados com captopril durante o curso da infecção desenvolvem menos fibrose e necrose do tecido cardíaco e redução da inflamação. Assim, nós decidimos investigar o papel do sistema de cininas na formação da cardiopatia chagásica, durante a fase da infecção experimental pelo T. cruzi. Nossos resultados demonstram que o sistema de cininas não é capaz de modular a curva de parasitemia, nem a celularidade de órgãos linfóides primários e secundários durante a fase aguda da infecção experimental, com a exceção de HOE-140, que foi capaz de inibir o aumento da celularidade descrito para linfonodos subcutâneos durante a fase aguda. Por outro lado, as cininas são capazes de modular a expressão de moléculas de matriz extracelular no coração. Nós observamos que a potencialização do sistema de cininas aumenta o infiltrado inflamatório na fase aguda, e que o bloqueio do B2R parece agravar essa situação, enquanto que o processo de formação da fibrose é inversamente proporcional ao aporte celular. Nossos dados sugerem que a via de cininas participa da formação da cardiopatia, durante a fase aguda da infecção e que possivelmente existe um mecanismo compensatório agindo através de B1R, para assumir parte da atividade vasoativa de B2R.

Aprotinin reverses ECG abnormalities induced by Mesobuthus tamulus concanesis, Pocock venom in adult rats.

The kinins are implicated in the pathogenesis of scorpion envenomation. Therefore, this study was carried out to examine the involvement of kinins for the ECG abnormalities induced by M. tamulus concanesis, (BT) venom in anaesthetized rats. ECG was recorded using needle electrodes with limb lead II configuration. The PR interval, QRS wave pattern, QRS duration, ST segment and heart rate were examined in saline only, venom alone, and venom after aprotinin groups. BT venom (5 mg/kg) produced heart block of varying degree and ischemia-like changes in ECG wave pattern and the animals died within 30 min after exposure to venom. In aprotinin pretreated animals, the initial ECG changes produced by venom persisted, but after 15 min the ECG pattern improved and the animals survived for the entire period of observation (120 min). The results indicate that aprotinin protected the rats against the cardiotoxicity induced by BT venom.

Rhodnius prolixus Malpighian tubules and control of diuresis by neurohormones

Rhodnius prolixus Malpighian tubules (MTs) are a good model for fluid and ion secretion studies in view of the dramatic postprandial diuresis, which follows its massive blood meals. Ingestion of a blood meal equals to 10-12 times their initial body mass, leads to rapid activation of high output by excretory system, which eliminates 40-50 percent of the fluid mass. Secretion of ions and water is stimulated 1000-fold by serotonin and diuretic hormone. These hormones cooperate synergistically to activate adenylate cyclase activity from MTs cells, which increase the level of intracellular cAMP. The anti-diuretic hormones have also an important role in the fluid maintenance of Rhodnius prolixus. Several hours after insect feeding occurs a reduction in urine flow, that has been thought to result from a decreased diuretic hormone release or from a novel mechanism of anti-diuresis involving insect cardioacceleratory peptide 2b (CAP2b) and cyclic GMP. In this article it is discussed how the hormone regulation of fluid transport is done in Rhodnius prolixus MTs.

Os túbulos de Malpighi (TMs) de Rhodnius prolixus são reconhecidos por serem excelentes modelos para o estudo da secreção de fluidos e íons devido a grande diurese que ocorre quando esses animais se alimentam de sangue. O inseto, após alimentação, pode aumentar seu peso corporal inicial em até 10-12 vezes, o que leva a rápida ativação do sistema excretor, que elimina 40-50 por cento do fluido corporal. A secreção de íons e água é estimulada 1000 vezes pela serotonina e pelos hormônios diuréticos. Esses hormônios agem sinergicamente ativando a adenil ciclase das células dos TMs, aumentando os níveis intracelulares de AMPc. Os hormônios anti-diuréticos também têm um importante papel na manutenção dos fluídos corporais do Rhodnius prolixus. Várias horas após a alimentação do inseto ocorre uma redução do fluxo urinário, o que foi sugerido ser decorrente da diminuição da liberação dos hormônios diuréticos ou da anti-diurese envolvendo o peptídeo cardioaceleratório 2b (CAP2b) e o GMPc. Neste artigo é discutida a regulação hormonal do transporte de fluido nos MTs de Rhodnius prolixus.

Effects of penile vasoactive mediators on the development of erectile dysfunction / 中华男科学杂志

Penile corpus cavernosum can be seen as a special kind of vascular structure. The cause of erectile dysfunction (ED) is often related to the changes of penile vasoactive mediators which modulate the functional conditions of penile erectile tissues. The penile vasoactive mediators including angiotensin and kinins, prostaglandins, endothelins, endothelium-derived hyperpolarizing factors (EDHF), NOS and NO, RhoA/Rho-kinases, etc., may play an important role in the development of ED. Further researches on these mediators can furnish some theoretical evidence for the clinical treatment of ED.

Efeito modulador do fator transformante de crescimento-beta (TGF-Beta) na resposta inflamatória em um modelo xenogênico de câncer / Modulatory effect of TGF-Beta in host inflammatory response in a xenogenic model of cancer

Os membros da família de fatores transformantes de crescimento-β(TGF-β) possuem propriedades imunomoduladoras, as quais podem determinar a supressão ou a progressão de tumores. Objetivo: Investigar o efeito do TGF-β no microambiente de hospedeiros em um modelo xenogênico de câncer. Métodos: Camundongos BALB/c imunocompetentes receberam injeções intraperitoneais de células da linhagem de adenocarcinoma de cólon humano LISP-A10, a qual produz TGF-β in vitro, antes ou depois da indução de uma inflamação local. Resultados: Injeções isoladas de células LISP-A10 viáveis não promoveram o desenvolvimento de tumores macroscópicos. Contudo, um significativo aumento na concentração de TGF-β nos fluidos peritoneais em paralelo à uma deficiente ativação da resposta imune específica dos hospedeiros foi observado. Quando uma inflamação local foi induzida pela administração de Adjuvante Completo de Freund após as injeções de células LISP-A10 viáveis, essas células foram recuperadas e isoladas da cavidade peritonealdos animais. Adicionalmente, a presença concomitante das células tumorais humanas viáveis com o agente inflamatório resultou em elevada produção local de TGF-β e em ineficiente ativação da resposta imune celular e humoral dos hospedeiros. Nestas condições experimentais, também se observou o desenvolvimento de lesões inflamatórias, semelhantes a pseudotumores inflamatórios humanos. A indução dos pseudotumores inflamatórios foi conseqüente à produção contínua e elevada de TGF-β local na presença do Adjuvante Completo de Freund. A enzima ciclooxigenas-2 e os receptores de cininas mostraram-se envolvidos com o aumento da produção de TGF-β e, consequentemente, com a formação das lesões inflamatórias neste modelo experimental. Conclusões: Em conjunto, os resultados mostram pela primeira vez que as células LISP-A10 produtoras de TGF-β podem permanecer na cavidade peritoneal de animais imunocompetentes e que a alta produção de TGF-β, na presença de Adjuvante Completo de Freund, pode levar ao desenvolvimento de lesões inflamatórias crônicas, sugestivas de pseudotumores inflamatórios.

Geração e caracterização de ratos transgênicos com superexpressão do receptor B1 de cininas do endotélio / Generation and characterization of rats overexpressing kinin B1 receptor gene on the endothelium

Parte I > TGR (Tie281): ratos transgênicos superexpressando o receptor 81 endotelial gerados, genotipados e inicialmente fenotipados expressão do transgene (TG) endotélio- específica in vitro: relaxamento da aorta é NO e canais de K+ -dependente in vivo: hipotensão em resposta ao agonista NO -dependente in vivo: menor hipotensão em resposta ao agonista R82 (8K) aumento de edema em resposta ao agonista acentuados níveis basais de NO plasmáticos menor expressão de ICAM-1 e E-Selectina e maior expressão de iNOS e MIP-2 em aorta .:. Caracterização da resposta ao choque endotóxico acentuada resposta hipotensora à LPS (5 mg/kg) acentuada bradicardia (2~ fase) mecanismos 1 a fase: hipotensão NO- dependente acentuados níveis de NO plasmáticos (1a.fase) acentuada mortalidade à LPS (1 mg/kg) Parte II .:. Caracterização da resposta hipertensora -dTGR (RenTie281) redução na hipertensão melhor função glomerular: menor excreção de proteína na urina e maior clearance de creatinina; menor expressão de colágeno 1-a, III e TGF-b...

Estudo da funçäo dos receptores B1 e B2 de cininas durante o desenvolvimento do modelo experimental de epilepsia, induzido por pilocarpina / Kinin bland B1 and B2 receptor function during the development of pilocarpine-induced epilepsy

OBJETIVO: Na epilepsia do lobo temporal a lesão neuroanatômica mais comumente encontrada é a esclerose hipocampal, que é caracterizada por perda neuronal no hilo do giro dentado, nos subcampos de CA 1 e CA3, e por atrofia hipocampal associada à gliose. Vários modelos animais de epilepsia mostraram um padrão similar de desorganização hipocampal, que inclui morte neuronal e desorganização da citoarquitetura como resultado de crises de longa duração, mediadas pela ação do glutamato. Estas características representam a esclerose hipocampal, normalmente encontrada em pacientes com epilepsia do lobo temporal, assim como em modelos experimentais de epilepsia. As cininas, uma classe especial de peptídeos, estão representadas pela bradicinina (BK), calidina (Lys-BK) e Met-Lys-BK. As ações biológicas dessas cininas sobre seus receptores (B 1 e B2) têm sido relacionadas com a formação de edemas, citocinas, liberação de glutamato e produção de prostaglandinas, assim como, na função imunológica. Geralmente, o receptor B 1 não é expresso em níveis significantes em tecidos normais, mas sua expressão é induzida por injúria ou após a exposição in vivo ou in vitro à mediadores pró-inflamatórios, tais como, os lipopolissacarídeos e citocinas. O receptor 132 é constitutivamente e amplamente expresso no sistema nervoso central e periférico. Tem sido mostrada que a expressão do receptor B2, assim como a do seu transcrito, é regulada positivamente pelo fator de crescimento neuronal NGF e muito menos pelo fator neurotrófico. Esses achados sugerem a possibilidade da expressão de novo dos receptores B 2 e 132 de cininas durante o fenõmeno epiléptico. Para esta proposta, ratos Wistar adultos selvagens e camundongos nocautes para o receptor 131 e B1, foram submetidos ao modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina, na tentativa de correlacionar o sistema cininas com o dano cerebral que ocorre após status...

T-kininogen inhibits kinin-mediated activation of ERK in endothelial cells

Serum levels of T-kininogen increase dramatically as rats approach the end of their lifespan. Stable expression of the protein in Balb/c 3T3 fibroblasts leads to a dramatic inhibition of cell proliferation, as well as inhibition of the ERK signaling pathway. T-kininogen is a potent inhibitor of cysteine proteinases, and we have described that the inhibition of ERK activity occurs, at least in part, via stabilization of the MAP kinase phosphatase, MKP-1. Since fibroblasts are not a physiological target of T-kininogen, we have now purified the protein from rat serum, and used it to assess the effect of T-kininogen on endothelial cells. Adding purified T-kininogen to EAhy 926 hybridoma cells resulted in inhibition of basal ERK activity levels, as estimated using appropriate anti-phospho ERK antibodies. Furthermore, exogenously added T-kininogen inhibited the activation of the ERK pathway induced by either bradykinin or T-kinin. We conclude that the age-related increase in hepatic T-kininogen gene expression and serum levels of the protein could have dramatic consequences on endothelial cell physiology, both under steady state conditions, and after activation by cell-specific stimuli. Our results are consistent with T-kininogen being an important modulator of the senescent phenotype in vivo

Regulaçäo da transcriçäo do gene do receptor B2 de bradicinina de rato: identificaçäo de um elemento silenciador / Transcriptional regulation of the rat bradykinin B2 receptor gene: identification of a silencer element

As cininas estao envolvidas em vários processos fisiológicos e fisiopatológicos relacionados à homeostase cardiovascular, inflamaçao, fluxo sanguíneo e nocicepçao. Em condiçoes fisiológicas, o receptor B2 da BK é expresso constitutivamente e medeia a maioria das açoes da BK incluindo reatividade vascular, respostas inflamatórias e proliferaçao celular. Entretanto, os mecanismos que regulam a expressao deste gene ainda sao pouco conhecidos. Neste estudo, uma seqüência de aproximadamente 5 kb da extremidade 5' do gene foi isolada e seqüenciada. Foram identificados diversos sítios de fatores de transcriçao no promotor como o GATA, SRE-1, CRE, GRE e o repressor CDP. Nove construçoes mutantes do promotor foram clonadas em vetores de gene repórter luciferase e transfectadas em células NG10815 e células musculares lisas de rato (CML-A), revelando vários elementos regulatórïos positivos (ERP) e negativos (ERN). Entretanto, as sequências regulatórias funcionaram como ativadoras ou inibidoras da transcriçao dependendo do tipo celular. Um elemento regulatório negativo de 56 pb causou diminuiçao na atividade do gene repórter em ambas as células e foi capaz de inibir o promotor heterólogo de timidina quinase, independente de orientaçao, sendo classificado como um silenciador clássico. Ensaio de modificaçao da mobilidade eletroforética (EMSA) e ensaio de ressonância de superfície (SPR) determinaram a ligaçao de proteínas no silenciador. sendo específicas para cada tipo celular. O silenciador foi dividido em três partes sendo observada a formaçao de complexos mais intensos no fragmento F2 nas células NG108-15 enquanto que nas CML-A a ligaçao de fatores de transcriçao foi exclusiva neste fragmento. Células NG108-15 tratadas com dBcAMP e diferenciadas foram utilizadas como modelo de regulaçao negativa do receptor BKB2. O RT-PCR para o receptor BKB2 com as células diferenciadas revelou uma menor quantidade de RNA mensageiro desse gene em comparaçao com as células indiferenciadas. O EMSA revelou a presença de complexos DNA-proteína mais intensos nas células NG108-15 diferenciadas, demonstrando que a regulaçao negativa do receptor ocorreu à nível transcricional causada pela maior ligaçao de fatores de transcriçao no silenciador. Desta forma podemos concluir que o receptor BKB2 apresenta um silenciador clássico em sua sequência e a regulaçao de sua transcriçao é célulaespecífica. Estudos posteriores serao necessários determinar os fatores específicos e os mecanismos ...(au)

Modelos de hipertrofia e proteçäo cardíaca em ratos que expressam o gene da calicreína tecidual humana / Hypertrophy models and cardioprotection in transgenic harboring human tissue kallikrein gene

Para avaliar as açoes cardiovasculares das cininas, geramos uma linhagem de ratos transgênicos que expressam o gene da calicreína tecidual humana, TGR(hKLK1). Sob o controle do promotor da metalotioneína indutivo a zinco, o transgene foi expresso na maioria dos tecidos incluindo o coraçao, rins, pulmoes e cérebro. A calicreína tecidual humana foi detectada na urina dos animais transgênicos. Os ratos transgênicos apresentaram uma menor pressao arterial média em comparaçao com ratos controle. Após uma dieta suplementada em zinco, a pressao arterial média dos animais transgênicos foi bruscamente diminuída devido à ativaçao da expressao do transgene. O ritmo da pressao sangüínea nos períodos dia/noite apresentou-se diminuído significativamente nos animais TGR(hKLK1), entretanto o ritmo circadiano da freqüência cardíaca e atividade locomotora nao foram alterados. A induçao de hipertrofia cardíaca pelo tratamento com isoproterenol revelou um efeito protetor marcante do transgene da calicreína devido ao diminuído aumento da massa do coraçao nos animais transgênicos TGR(hKLK1). A expressao gênica do peptídeo natriurético atrial e colágeno III, marcadores moleculares de hipertrofia cardíaca e fibrose do miocárdio, após o tratamento com isoproterenol nos animais transgênicos TGR(hKLK1). O antagonista específico do receptor B2 de cininas, icatibant (HOE140), aboliu completamente esta cardioproteçao nos ratos transgênicos. Resultados comparáveis foram obtidos com o tratamento da linhagem transgênica com o hormônio da tireóide, com a coartaçao da aorta e com a geraçao de uma linhagem de ratos duplo transgênicos que expressam nao somente o gene da calicreína tecidual humana bem como o gene 2 da renina de camundongo. Nestes modelos, também foi observada uma cardioproteçao. Em conclusao, o sistema calicreína-cininas é um determinante importante na regulaçao da pressao arterial e no ritmicidade circadiana. Este sistema também exerce açoes anti-hipertróficas e anti fibróticas no coraçao

Efeitos das cininas em células mesangiais de camundongo / Effects of kinins on mouse mesangial cells

A bradicinina (BK) age em células mesangiais.(CM) induzindo aumento da concentração citosólica de cálcio [Ca++]i, contração, secreção e endocitose de partículas, síntese e proliferação celular. As CM, por sua vez, exercem um papel fundamental no controle da hemodinâmica glomerular. Este estudo analisa a ação da BK e análogos sobre CM imortalizadas de camundongo (CMIC), com enfoque especial às variações da [Ca++]i, avaliadas por espectrofluorimetria, empregando o corante fura-2-AM. Os resultados foram expressos como a razão entre [Ca++]i obtida/[Ca++]i basal. A BK (O,1 mM) induziu aumentos importantes na [Ca++]i de CMIC (4,70ñ0,27, N=28), e comportamento similar foi apresentado pelo agonista seletivo de receptores do subtipo B2 (B2R), Tyr8 -BK (O,1 mM, 3,34ñ0,48, n=7), mas não pelos agonistas seletivos de receptores B1 (B1R), des-Arg9-K (O,1 mM, 1,12ñ0,04, N=8) e des-Arg10-calidina (Kal) (O,l mM, 1,45ñ0,08, N=11). Dessensibilização de respostas foi observada após administração consecutiva de BK e Tyr8-BK e vice-versa, mas não entre BK e des-Arg10-Kal. Enquanto o antagonista de B2R, HOE 140(O,1 mM), reduziu significativamente a ação da BK (5,09ñ0,30, N=6 vs. 1,57ñ0,12, N=7, p

Vasopressin and bradykinin receptors in the kidney: implications for tubular function

Vasopressin and bradykinin are two of the most important peptides in regulating vascular tone, water, and ionic balance in the body, adn thus they play a key role in controlling blood pressure. In addition to being a potent vasoconstrictor, Vasopressin also has an antidiuretic activity in the kidney, whereas kinins regulate renal blood flow in addition to their vasodilatory and natriuretic activity. We review here the primary evidence for the localization of the vasopressin and kinin receptors and their role in ionic and water regulation in the kidney.

Evidence for the presence of a kininogen-like species in a case of total deficiency of low and high molecular weight kininogens

Low and high molecular weight kininogens (LK and HK), containing 409 and 626 amino acids with masses of ~65 and 120120 kDa after glycosylation, respectively, are coded by a single gene mapped to the human chromosome 3 by alternative splicing of the transcribed mRNA. The NH2-termini Glu(1)-Thr(383) region, identical in LK and HK, contains bradykinin (BK) moieties Arg(363)-Arg(371). LK, HK and their kinin products Lys-BK and BK are involved in several biological processes. They are evolutionarily conserved and only 7 patients, all apparently normal, have been reported to lack them. In one of these patients (Williams'trait), a codon mutation (Arg(178) r stop) has been blamed for the absence of LK and HK. However, using Western blots with 2 monoclonal anti-HK antibodies, one that recognizes the region common to LK and HK and the other that recognizes only HK, I detected ~110-kDa bands in the plasma of this LK/HK-deficient patient vs ~120-kDa bands in normal human and ape plasmas. With polyclonal anti-Lys-BK antibody, which strongly detects BK eleaved at its COOH-terminus in purified HK, I detected ~110-kDa bands in the normal and the deficient plasmas. Western blots with a monoclonal anti-prekallikrein (PK) antibody showed that surface activation of PK and distribution of PK activation products, both dependent on HK, were similar in these plasmas. These findings suggest that a mutant gene yielded a kininogen-like species possibly involving aberrant mRNA splicing - structurally different from normal HK, but apparently with the capacity to carry out seemingly vital HK functions.

Tópicos farmacológicos atuais sobre as cininas na clínica / Actual pharmacologic topics about kinins in clinic

Os autores destacam os conhecimentos básicos sobre o sistema calicreínacinina, abordando seus aspectos bioquímicos fundamentais e evidenciando sua relevância farmacológica na prática médica atual