Epimastigogénesis de Trypanosoma cruzi: método para estudiar in vivo la transformación de tripomastigota en epimastigota / Trypanosoma cruzi epimastigogenesis: a method for studying Trypomastigote to epimastigote transformation in vivo

La epimastigogénesis de Trypanosoma cruzi ocurre naturalmente en el intestino del hospedador invertebrado. Se desconoce si los cambios morfológicos que ocurren durante la transformación de los tripomastigotas sanguíneos en epimastigotas son idénticos para diferentes aislados de T. cruzi. Aquí mostramos un método útil para estudiar los eventos que ocurren durante la epimastigogénesis, comparando parásitos de diferentes procedencias epidemiológicas. Se alimentaron artificialmente ninfas de V estadio de Rhodnius prolixus con una solución ad hoc conteniendo tripomastigotas tipo-sanguíneo y siguiendo los cambios morfológicos por 8 días. Los contenidos del intestino anterior de las ninfas se obtuvieron decapitando y comprimiendo el abdomen lo que permitió obtener rápidamente casi 100% del inóculo con cargas entre 1,9 y 8,9 × 106 tripomastigotas/ninfa. El número de parásitos por ninfa y los cambios morfológicos se determinaron por Microscopia de Contraste de Fases y coloración con Giemsa. Las ninfas ingirieron 7,4 veces su peso de solución infectante, con volúmenes entre 101 y 357 µL (229 ± 66 mg), 50% de esa ingesta se eliminó como orina durante las primeras 24 h. Los tripomastigotas se transformaron en formas redondeadas antes de evolucionar a epimastigotas, siguiendo cinéticas diferentes según el aislado. Proponemos esta metodología para estudiar rápida y cuantitativamente los eventos tempranos de la epimastigogénesis de T. cruzi in vivo.

Trypanosoma cruzi epimastigogenesis naturally occurs in the intestine of the invertebrate host. It is not known whether the morphological changes that occur during transformation of bloodstream trypomastigotes to epimastigotes are identical for different T. cruzi isolates. This research shows a useful method for studying the events that occur during epimastigogenesis, comparing parasites from epidemiological sources. Rhodnius prolixus V stage nymphs were fed artificially with an ad hoc solution containing blood-like trypomastigotes and the morphological changes were examined during eight days. Anterior intestinal contents were removed by decapitation and squeezing the abdomen of the nymphs, which permitted obtaining quickly almost 100% of the inoculate with loads between 1.9 and 8.9 × 106 trypomastigotes/nymph. The number of parasites per nymph and morphological changes were determined using phase microscopy with Giemsa staining. The nymphs ingested 7.4 times their weight of the infecting solution with volumes between 101 e 357 µL (229 ± 66 mg); 50% of the ingest was eliminated as urine during the first 24 hours. The trypomastigotes transformed to rounded forms before evolving into epimastigotes following different kinetics according to the isolate. This method is proposed for rapid, quantitative study of the early events of epimastigogenesis for T. cruzi in vivo.

Novas perspectivas de fármacos com propriedade tripanocida: estudos biológicos de compostos heterocíclicos / Novel perspectives of drugs with tripanocidal properties: biological study of heterocyclic compounds

Os compostos mesoiônicos são moléculas não aromáticas planas, pertencentes à classe das betaínas, os quais apresentam um grande número de atividades biológicas incluindo antibacteriana, anti-inflamatória e anti-protozoária. A despeito do potencial quimoterápico destes compostos, estudos destas moléculas contra o Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, ainda são incipientes. No presente trabalho nós avaliamos as atividades tripanocida e citotóxica dos mesoiônicos MECPYR-04, MEC-02, MC-01 e MC-02. Nossos resultados demonstraram que todos os compostos inibiram o crescimento de formas epimastigotas e causaram decréscimo da viabilidade celular em tripomastigotas. Estes compostos também foram efetivos em inibir a infecção de macrófagos e diminuir a viabilidade das formas amastigotas. MECPYR-04 foi o mais efetivo contra todas as formas evolutivas do parasito, entretanto também apresentou alta toxicidade para células de mamíferos, enquanto MEC02, MC-01 e MC-02 apresentaram baixa toxidade em células de mamíferos e alta seletividade para os parasitas. Apenas MEC-02 e MECPYR-04 aumentaram a produção de NO em macrófagos quando comparados com o controle, sugerindo um potencial imunomodulatório destes compostos. Com objetivo de analisar os efeitos de MEC-02, MC-01 e MC-02 sobre a integridade da membrana plasmática e o potencial de membrana mitocondrial, células tratadas e controles foram submetidas a marcação com iodeto de propidio e rodamina 123 respectivamente, e analisadas por microscopia confocal. Nenhuma diferença significativa na integridade da membrana foi observada em células tratadas. Estes achados foram confirmados pela microscopia eletrônica de varredura. Apenas MC-01 e MC-02 foram capazes de induzir alterações no potencial de membrana mitocondrial como observado por microscopia confocal e citometria de fluxo. Análise ultraestrutural revelou apenas pequenas alterações em formas tripomastigotas tratadas com MEC-02. Por outro lado, células tratadas com MC-01 e MC-02 apresentaram drástico inchaço da mitocôndria com desorganização ou perda do material da matriz mitocondrial, sugerindo que esta estrutura seja o alvo de ação de MC-01 e MC-02. Todos estes resultados apontam MEC-02, MC-01 e MC-02 como candidatos a fármacos contra a doença de Chagas.

Active transcription and ultrastructural changes during Trypanosoma cruzi metacyclogenesis

The differentiation of proliferating epimastigote forms of Trypanosoma cruzi , the protozoan parasite that causes Chagas’ disease, into the infective and non-proliferating metacyclic forms can be reproduced in the laboratory by incubating the cells in a chemically-defined medium that mimics the urine of the insect vector. Epimastigotes have a spherical nucleus, a flagellum protruding from the middle of the protozoan cell, and a disk-shaped kinetoplast - an organelle that corresponds to the mitochondrial DNA. Metacyclic trypomastigotes have an elongated shape with the flagellum protruding from the posterior portion of the cell and associated with a spherical kinetoplast. Here we describe the morphological events of this transformation and characterize a novel intermediate stage by three-dimensional reconstruction of electron microscope serial sections. This new intermediate stage is characterized by a kinetoplast compressing an already elongated nucleus, indicating that metacyclogenesis involves active movements of the flagellar structure relative to the cell body. As transcription occurs more intensely in proliferating epimastigotes than in metacyclics, we also examined the presence of RNA polymerase II and measured transcriptional activity during the differentiation process. Both the presence of the enzyme and transcriptional activity remain unchanged during all steps of metacyclogenesis. RNA polymerase II levels and transcriptional activity only decrease after metacyclics are formed. We suggest that transcription is required during the epimastigote-to-metacyclic trypomastigote differentiation process, until the kinetoplast and flagellum reach the posterior position of the parasites in the infective form.

A diferenciação de formas epimastigotas (proliferativas) do Trypanosoma cruzi, parasita protozoário causador da doença de Chagas, em formas metacíclicas tripomastigotas (infectivas e não proliferativas), pode ser reproduzida em laboratório incubando-se as células em um meio quimicamente definido que imita a urina do inseto vetor deste parasita. Os epimastigotas têm um núcleo esférico, o flagelo se projeta da metade do corpo do protozoário e o cinetoplasto (organela que possui o DNA mitocondrial) possui formato de disco. Os tripomastigotas metacíclicos têm um núcleo alongado com o flagelo emergindo da extremidade posterior da célula associado ao cinetoplasto esférico. Neste trabalho descrevemos as mudanças morfológicas que ocorrem durante essa transformação e caracterizamos uma nova forma intermediária do parasita usando reconstrução tridimensional de cortes seriados, visualizados por microscopia eletrônica de transmissão. Essa nova forma intermediária é caracterizada pela compressão do cinetoplasto contra o núcleo alongado, indicando que a metaciclogênese envolve movimentos ativos do cinetoplasto associado à estrutura flagelar em relação ao corpo celular. Como tripomastigotas metacíclicos transcrevem menos que as formas epimastigotas proliferativas, verificamos a presença da RNA polimerase II e medimos a atividade transcricional durante o processo de diferenciação. A presença da enzima e a atividade transcricional permanecem inalteradas durante todas as etapas da metaciclogênese, desaparecendo apenas quando as formas metacíclicas são formadas. Sugerimos que a diferenciação requer uma atividade transcricional, necessária para uma intensa remodelação da célula, que acontece até o cinetoplasto e o flagelo atingirem uma posição posterior do corpo do tripomastigota metacíclico.

Impairment of cell division of Trypanosoma cruzi epimastigotes

The mechanisms that facilitate the adaptation of Trypanosoma cruzi to two distinct hosts, insect and vertebrate, are poorly understood, in part due to the limited ability to perform gene disruption studies by homologous recombination. This report describes a developmentally-defective phenotype that resulted from integration of a drug marker adjacent to the GAPDH gene in T. cruzi.

Methylene blue vital staining for Trypanosoma cruzi trypomastigotes and epimastigotes

The morphological identification of Trypanosoma cruzi is currently considered to have a high specificity, but its sensitivity, which depends on the volume of the sample examined, is rather low. Trypanosome developmental stages suspended in blood, reduviid feces, and culture media are routinely searched for by means of fresh film examination (about 2 æL). High speed centrifugation of blood samples separates the buffy coat, where most trypomastigotes concentrate. As the parasites are transparent and colorless, their detection is mostly dependent on their motility. The fluorescent vital stain acridine orange has been used to enhance image contrast, as exemplified by the QBC (Quantitative Buffy Coat) technique. Staining blood, buffy coat, reduviid feces, and culture media samples with methylene blue (also a vital dye) is a means of producing sharp, well contrasted images of motile or non-motile T. cruzi developmental stages, only standard laboratory microscopes being required. Slides previously coated with a thin layer of methylene blue are used to stain fresh blood films. Photomicrographs exemplify the results of methylene blue staining applied to living and fixed parasites.

A identificação morfológica de Trypanosoma cruzi tem alta especificidade, segundo é geralmente aceito; entretanto, sua sensibilidade, dependente do volume da amostra examinada, é baixa. Formas evolutivas de T. cruzi suspensas em sangue, fezes de reduviídeos e meios de cultura são rotineiramente pesquisadas em esfregaços a fresco (cerca de 2 æL). Centrifugação de amostras de sangue a altas velocidades produz a separação do creme leucocitário, onde se concentram as formas tripomastigotas. Em preparações a fresco, a motilidade das formas tripomastigotas e epimastigotas de T. cruzi, protozoário transparente e incolor, facilita sua detecção. Laranja de acridina, corante vital fluorescente, tem sido usada para acentuar o contraste das imagens de parasitas. Disto é exemplo a técnica QBC (Quantitative Buffy Coat). A coloração por meio de azul de metileno (também um corante vital), de amostras de sangue, de fezes de reduviídeos ou de meios de cultura permite obter imagens nítidas e contrastadas de formas evolutivas de T. cruzi com ou sem motilidade. Microscópios de uso geral em laboratórios permitem o exame dos parasitas corados. Uma camada bem delgada de azul de metileno colocada sobre a parte central da lâmina limpa (por meio da evaporação de solução diluída do corante) é usada para corar as preparações a fresco. O aspecto dos parasitas corados em materiais frescos ou previamente fixados pode ser observado em fotomicrografias.

Two special organelles found in Trypanosoma cruzi

We review here two unique organelles from Trypanosoma cruzi. One of them is the acidocalcisome, cytoplasmic vacuoles containing a very high Ca2+ concentration and a Ca2+ - H+ translocating ATPase activity, present in all trypanosomatids. The other organelle is the reservosome, site of accumulation of endocytosed macromolecules, very rich in cysteine proteinase, that is present only in epimastigote forms of trypanosomes belonging to the Schyzotrypanum sub-genus.

Genomic rearrangements in trypanosomatids: an alternative to the "One Gene" evolutionary hypothesis?

Most molecular trees of trypanosomatids are based on point mutations within DNA sequences. In contrast, there are very few evolutionary studies considering DNA (re) arrangement as genetic characters. Waiting for the completion of the various parasite genome projects, first information may already be obtained from chromosome size-polymorphism, using the appropriate algorithms for data processing. Three illustrative models are presented here. First, the case of Leishmania (Viannia) braziliensis/L. (V.) peruviana is described. Thanks to a fast evolution rate (due essentially to amplification/deletion of tandemly repeated genes), molecular karyotyping seems particularly appropriate for studying recent evolutionary divergence, including eco-geographical diversification. Secondly, karyotype evolution is considered at the level of whole genus Leishmania. Despite the fast chromosome evolution rate, there is qualitative congruence with MLEE- and RAPD-based evolutionary hypotheses. Significant differences may be observed between major lineages, likely corresponding to major and less frequent rearrangements (fusion/fission, translocation). Thirdly, comparison is made with Trypanosoma cruzi. Again congruence is observed with other hypotheses and major lineages are delineated by significant chromosome rearrangements.

A short review on the morphology of Trypanosoma cruzi: from 1909 to 1999

The morphology of Trypanosoma cruzi is reviewed since the initial description of Giemsa-stained preparations by Carlos Chagas until the most recent micrographs obtained with freeze-fracture techniques. Special emphasis is given to structures such as the cell surface, the flagellum, the kinetoplast, the reservosomes and the endocytic pathway, and the acidocalcisomes.

Features of host cell invasion by different infective forms of Trypanosoma cruzi

Through its life cycle from the insect vector to mammalian hosts Trypanosoma cruzi has developed clever strategies to reach the intracellular milieu where it grows sheltered from the hosts' immune system. We have been interested in several aspects of in vitro interactions of different infective forms of the parasite with cultured mammalian cells. We have observed that not only the classically infective trypomastigotes but also amastigotes, originated from the extracellular differentiation of trypomastigotes, can infect cultured cells. Interestingly, the process of invasion of different parasite infective forms is remarkably distinct and also highly dependent on the host cell type.

Internalization of components of the host cell plasma membrane during infection by Trypanosoma cruzi

Epimastigote and trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi attach to the macrophage surface and are internalized with the formation of a membrane bounded vacuole, known as the parasitophorous vacuole (PV). In order to determine if components of the host cell membrane are internalized during formation of the PV we labeled the macrophage surface with fluorescent probes for proteins, lipids and sialic acid residues and then allowed the labeled cells to interact with the parasites. The interaction process was interrupted after 1 hr at 37§C and the distribution of the probes analyzed by confocal laser scanning microscopy. During attachment of the parasites to the macrophage surface an intense labeling of the attachment regions was observed. Subsequently labeling of the membrane lining the parasitophorous vacuole containing epimastigote and trypomastigote forms was seen. Labeling was not uniform, with regions of intense and light or no labeling. The results obtained show that host cell membrane lipids, proteins and sialoglycoconjugates contribute to the formation of the membrane lining the PV containing epimastigote and trypomastigote T. cruzi forms. Lysosomes of the host cell may participate in the process of PV membrane formation.

Trypanosoma cruzi-cardiomyocytes: new contributions regarding a better understanding of this interaction

The present paper summarizes new approaches regarding the progress done to the understanding of the interaction of Trypanosoma cruzi-cardiomyocytes. Mannose receptors localized at the surface of heart muscle cell are involved in binding and uptake of the parasite. One of the most striking events in the parasite-heart muscle cells interaction is the disruption of the actin cytoskeleton. We have investigated the regulation of the actin mRNA during the cytopathology induced in myocardial cells by the parasite. T. cruzi invasion increases calcium resting levels in cardiomyocytes. We have previously shown that Ca2+ ATPase of the sarcoplasmic reticulum (SERCA) is involved in the invasion of T. cruzi in cardiomyocytes. Treating the cells with thapsigargin, a drug that binds to all SERCA ATPases and causes depletion of intracellular calcium stores, we found a 75 per cent inhibition in the T. cruzi-cardiomyocytes invasion.

Efectos autonómicos de la administración aguda de metoprolol en sujetos asintomáticos seropositivos a T. cruzi

Objetivo: Evaluar el efecto agudo del metoprolol sobre la función autonómica cardiaca en sujetos seropositivos para T. cruzi asintomáticos. Métodos: Un estudio aleatorizado doble ciego, cruzado, placebo controlado fue realizado en 18 sujetos asintomáticos con serología positiva para T. cruzi. Presión arterial no invasiva y frecuencia cardíaca (FC) fueron registradas continuamente. Las intervenciones al azar fueron: 1 Bolos sucesivos de metoprolol de 5 mg i.v (5 cc) cada 5 minutos, máximo 15 mg (15 cc) buscando disminuir en un 20 por ciento la FC y 2. Bolos sucesivos de solución salina normal (SSN) de 5 cc hasta 3 dosis cada 5 minutos utilizando el mismo criterio. Los marcadores autonómicos calaculados previo y posterior a la intervención: 1. variabilidad de la FC en reposos durante 5 minutos, poder total (TP), poder de baja (LFn) y alta frecuencia (HFn) en unidades normalizadas, ïndice LF/HF y RMSSD. 2. Sensibilidad barorrefleja (BRS) utilizando bolos de fenilefrina (FNF) 150 Mg y nitropusiato (NTP) 100 Mg. El estudio se realizó en dos días consecutivos. Resultados: Los marcadores de la actividad tónica vagal (promedioñSD) antes y después de de la intervención con metoprolol fueron: FC 62.3ñ1.7 vs 55.6ñ1.6 lat/min, LFn 62.8ñ4.4 vs 49.8ñ4.7 ms², LF/HF 2.67ñ0.4 vs 1.42ñ0.2 y RMSSD 26.8ñ3.6 vs 41.9ñ6.4 ms, con valores de p<0.05. Conclusiones: La administración de metoprolol mejoró los marcadores de actividad tónica vagal, sin alterar el tono vagal fásico evaluado por la SBR. Los reflejos cardiovagales pueden ser modificados por la administración aguda de metoprolol en sujetos asintomáticos seropositivos para T. cruzi. Palabras clave: Enfermedad de Chagas, metoprolol, sistema nervioso autónomo, barorreflejo

Estudo biológico e molecular de cepas de trypanosoma cruzi isoladas de pacientes HIV positivos: a imunossupressão experimental como sistema modelo

No presente trabalho, investigamos a estrutura molecular e o comportamento biológico de cepas de Trypanosoma cruzi, isoladas de pacientes chagásicos crônicos, coinfectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e associados ou não à hemofilia, visando avaliar o impacto da imunossupressão na diversidade genética e biológica do parasita. Um esquema experimental foi elaborado para a manutenção destes isolados em camundongos e em culturas axênicas, permitindo a ação de pressões seletivas. O modelo murino experimental proposto permitiu o estudo das subpopulações selecionadas, como também o acompanhamento do curso da infecção e da reativação, após a imunossupressão na fase crônica. A heterogeneidade das cepas foi demonstrada através da análise do polimorfismo de fragmentos de restrição do kDNA (RFLP) e da eletroforese de multilocos enzimáticos (MLEE). A análise numérica, baseada nos dados moleculares, permitiu o agrupamento das mesmas em zimodemas domésticos e silvestres

As cepas, pertencentes ao grupo de zimodemas silvestres, revelaram parasitismo mais intenso no tecido cardíaco que aquelas pertencentes ao grupo do zimodema doméstico. Uma das cepas mostrou-se mais diferenciada pelos padrões genotípicos e fenotípicos, porém a análise numérica incluiu-a no grupo das cepas silvestres. As cepas revelaram diferentes padrões de virulência e patogenicidade com a presença de tripomastigotas sangüíneos de formas largas. Através do modelo experimental, in vivo e in vitro, foi possível demonstrar que um mesmo paciente estava infectado com pelo menos, três subpopulações de T. cruzi. Uma subpopulação predominou in vivo. Uma outra, proveniente do cultivo in vitro, porém distinta quando inoculada em camundongo recuperou o perfil observado in vivo. As subpopulações, que emergiram dos camundongos, após a imunossupressão, foram iguais entre si, porém divergentes da população parental. Baixa virulência e patogenicidade foram características marcantes destas subpopulações, quando inoculadas nas três linhagens de camundongos imunocompetentes

A reativação foi observada após a imunossupressão, com um quadro aumentado de virulência e mortalidade. Entretanto, os animais mantiveram o mesmo padrão histopatológico do coração e do cérebro quando comparados com os imunocompetentes. O modelo experimental nos permitiu contribuir para o entendimento da dinâmica populacional das cepas de T. cruzi e da patogênese da doença de Chagas

Estudo biológico e molecular de cepas de trypanosoma cruzi isoladas de pacientes HIV positivos: a imunossupressão experimental como sistema modelo / molecular biological study of strains of Trypanosoma cruzi strains isolated from HIV-positive patients: immunosuppression as experimental model system

No presente trabalho, investigamos a estrutura molecular e o comportamento biológico de cepas de Trypanosoma cruzi, isoladas de pacientes chagásicos crônicos, coinfectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e associados ou não à hemofilia, visando avaliar o impacto da imunossupressão na diversidade genética e biológica do parasita. Um esquema experimental foi elaborado para a manutenção destes isolados em camundongos e em culturas axênicas, permitindo a ação de pressões seletivas. O modelo murino experimental proposto permitiu o estudo das subpopulações selecionadas, como também o acompanhamento do curso da infecção e da reativação, após a imunossupressão na fase crônica. A heterogeneidade das cepas foi demonstrada através da análise do polimorfismo de fragmentos de restrição do kDNA (RFLP) e da eletroforese de multilocos enzimáticos (MLEE). A análise numérica, baseada nos dados moleculares, permitiu o agrupamento das mesmas em zimodemas domésticos e silvestres. As cepas, pertencentes ao grupo de zimodemas silvestres, revelaram parasitismo mais intenso no tecido cardíaco que aquelas pertencentes ao grupo do zimodema doméstico. Uma das cepas mostrou-se mais diferenciada pelos padrões genotípicos e fenotípicos, porém a análise numérica incluiu-a no grupo das cepas silvestres. As cepas revelaram diferentes padrões de virulência e patogenicidade com a presença de tripomastigotas sangüíneos de formas largas. Através do modelo experimental, in vivo e in vitro, foi possível demonstrar que um mesmo paciente estava infectado com pelo menos, três subpopulações de T. cruzi. Uma subpopulação predominou in vivo. Uma outra, proveniente do cultivo in vitro, porém distinta quando inoculada em camundongo recuperou o perfil observado in vivo. As subpopulações, que emergiram dos camundongos, após a imunossupressão, foram iguais entre si, porém divergentes da população parental. Baixa virulência e patogenicidade foram características marcantes destas subpopulações, quando inoculadas nas três linhagens de camundongos imunocompetentes. A reativação foi observada após a imunossupressão, com um quadro aumentado de virulência e mortalidade. Entretanto, os animais mantiveram o mesmo padrão histopatológico do coração e do cérebro quando comparados com os imunocompetentes. O modelo experimental nos permitiu contribuir para o entendimento da dinâmica populacional das cepas de T. cruzi e da patogênese da doença de Chagas.

Morphological and morphometric variability of three clones of Trypanosoma cruzi and the strain of origen (Bolivia) / Morphological and morphometric variability of three clones of Trypanosoma cruzi and the strain of origin (Bolivia)

Knowing the great divesity of medical and biological properties of Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas'disease, we quantified the morphological parameters that typify the different forms of three clones of T. cruzi and their original strain, Bolivia, in comparison among themselves and with strain Bolivia, attempting to provide additional data concerning the clonal biological behaviour of this parasite. Blood forms morphology was quantified using a computarized image analysis (Videoplan/Kontron) and statistical analysis was determined using ANOVA-1 Test. Large number of quantitative differences among slender, broad, and stout forms were found. The comparison of clones I, II and III with their mother strain, leads to the emergence of significant differences in at least 12 parameters out of the 16 we studied. When clones were compared among themselves, the differences decrased. Variations of the percentagens of the three kinds of clones were found along the acute infection. These data are the first step in correlating the morphological and pathogenic characteristics of the parasite.

Characterization of T cell clones from chagasic patients: predominance of CD8 surface phenotype in clones from patients with pathology

Human Chagas' disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is associated with pathological processes whose mechanisms are not known. To address this question, T cell lines were developed from chronic chagasic patients peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and cloned. These T cell clones (TCC) were analyzed phenotypically with monoclonal antibodies by the use of a fluorescence microscope. The surface phenotype of the TCC from the asymptomatic patient were predominantly CD4 positive (86 por cento). On the contrary, the surface phenotype CD8 was predominant in the TCC from the patients suffering from cardiomegaly with right bundle branch block (83 por cento), bradycardia with megacolon (75 por cento) and bradycardia (75 por cento). Future studies will be developed in order to identify the antigens eliciting these T cell subpopulations.