Caracterização estrutural e funcional de uma metaloproteinase de classe P-I do veneno de Lachesis muta rhombeata

Rhomb-I, a 23-kDa metalloproteinase was isolated from L. m. rhombeata venom. Its dimethylcasein proteolysis was abolished by metal chelators, and slightly enhanced by Ca2+ and Mg2+ ions, but inhibited by Co2+ , Zn2+ and α2-macroglobulin. In aqueous solution, rhomb-I autoproteolyzed to a 20- and 11-kDa fragments at 37 oC. The amino acid sequence showed high homology with other SVMPs. Rhomb-I causes hemorrhage that may be ascribed to hydrolysis of essential BM, ECM and plasma proteins. It preferentially cleaves the α-chains of fibrin(ogen). Rhomb-I inhibited convulxin- and vWF-induced aggregation on human platelets without significant effect on collagen-stimulated aggregation or other effectors. It digests vWF into a low- molecular-mass multimers of vWF and a rvWF-A1 domain to a 27-kDa fragment as revealed by western blotting with mouse anti-rvWF A1-domain IgG. Incubation of platelets with rhomb-I resulted in adhesion to and cleavage of platelet receptors GPIbα and GPVI to release a 130-kDa and 55-kDa soluble form. Both membrane glycoproteins, GPIbα that binds vWF, together with GPVI which binds collagen, play a key role in mediating platelet adhesion/activation and can initiate (patho)physiological thrombus formation. Conclusions: rhomb-I is implicated in the pathophysiology of Lachesis envenoming by disrupting vasculature, hemostasis and platelet aggregation through impairing vWF-GPIb axis and blocking GPVI-collagen binding.

Rhomb-I, uma metaloproteinase de 23 kDa foi isolada do veneno de L. m. rhombata. Sua ação proteolítica sobre dimetilcaseína foi inibida por α2-macroglobulina, quelantes de metais e por cátions Co2+ e Zn2+ e levemente estimulada por Ca2+ e Mg2+ . Em solução aquosa a 37 oC, rhomb-I sofreu autoproteólise gerando fragmentos de aproximadamente 20 e 11 kDa. A sequência de aminoácidos apresentou alta similaridade com outras SVMPs P-I. Rhomb-I causa hemorragia que pode ser atribuída à hidrólise de proteínas da membrana basal, da matriz extracelular e proteínas plasmáticas. Rhomb-I cliva, preferencialmente, as cadeias Aα da fibrina e do fibrinogênio. Rhomb-I inibiu a agregação induzida por convulxina e pelo fator de von Willebrand (vWF) em plaquetas humanas, sem efeito significativo na agregação estimulada por colágeno ou outros agonistas. Ela digere vWF em multímeros de massas moleculares menores bem como o domínio A1 recombinante de vWF (rvWF- A1) gerando um fragmento de aproximadamente 27 kDa, conforme evidenciado por western blot com IgG anti-rvWF-A1, produzido em camundongos. Após incubar plaquetas lavadas com rhomb-I, foi possível observar por western blot que a proteína liga e cliva as glicoproteínas de plaquetas GPIb e GPVI, liberando as formas solúveis de 130 kDa e 55 kDa, respectivamente. Ambas glicoproteínas, GPIbα que se liga ao vWF, e GPVI que se liga ao colágeno, desempenham um papel fundamental na mediação da adesão/ativação plaquetária e podem iniciar a formação fisiológica ou patológica de trombos. Conclusões: Rhomb-I é uma metaloproteinase classe P-I, hemorrágica, fibrino(geno)lítica que degrada proteínas da matriz extracelular e interfere na função plaquetária pela clivagem de vWF, GPIb e GPVI. Estes resultados indicam que rhomb-I pode estar envolvida na fisiopatologia do envenenamento por Lachesis, perturbando a hemostasia e agregação plaquetária e causando danos à vasculatura.

Reprogramação metabólica e de função do macrófago por crotoxina

Macrophages (MØ) are cells with high plasticity that can be reprogrammed into two distinct phenotypes – MØ M1 (pro-inflammatory) and MØ M2 (pro-resolving) – according to the nature of the disorder detected in the organism. Experimentally, it is already possible to induce the reprogramming of macrophages to M1 and M2 and the functional and metabolic status of both phenotypes have already been characterized. Previous studies by our group have shown that Crotoxin (CTX) exerts two actions on macrophages that make them suitable in cell therapy: 1) it alters their metabolic and functional profile and 2) these effects are long-lasting. Such effects are observed after a single, short exposure to the toxin. In this context, this research sought to characterize the metabolism and functional status of MØ treated with different concentrations of CTX, with the aim of verifying whether in each concentration it is possible to identify different phenotypes and activation states of the already identified M1 and M2 profiles, in order to seek to reprogram these cells according to specific pathophysiological processes. The capacity for phenotypic reprogramming of monocytes induced by CTX was evaluated in in vitro assays, using cells of the human monocytic lineage (THP-1), previously incubated with RPMI medium (control), or LPS (1ug/mL) or tumor conditioned medium of MCF7 cells (MCT) for 48 hours. Subsequently, they were incubated in the absence (control) or presence of CTX at different concentrations (2 nM; 10 nM; 50 nM and 100 nM) for 1 hour. After the different incubation protocols with the toxin, the differentiation and phenotype markers were analyzed using the qPCR technique, and the latter were also analyzed using flow cytometry. To evaluate the effects of treatments on cellular functions, the phagocytosis capacity, the generation of reactive oxygen species (H2O2) and the production of cytokines by MØ were observed. Cellular metabolism was evaluated through gene expression and activity of key enzymes of the glycolytic pathway. The data presented show that THP-1 cells are satisfactorily differentiated by LPS (1 µg/mL) and tumor environment-MCT (vol. obtained from 1x106 /mL) and these cells have their functions modulated distinctly by CTX, depending on the concentration used. CTX had a dual action on the functions of these human macrophages, since it induced phagocytosis activity, while at the same time stimulated the production of H2O2 in control cells. However, these effects vary depending on the microenvironment stimuli, since, in a tumor and inflammatory context, phagocytosis was preserved in a concentration-dependent manner, concomitant with the increase in H2O2 release in some concentrations. Regarding the metabolic pathways, the undifferentiated THP-1 cells did not show alteration in the gene expression of any of the evaluated glycolytic enzymes, under the effect of any concentration of CTX, suggesting that the toxin does not modulate the expression of these enzymes in the THP-1 cell in monocyte condition. However, when stimulated by LPS and MCT, CTX modulated the gene expression of some enzymes: the 50 nM concentration increased the expression of enzymes from metabolic pathways that are more active in M1 (PFK, FAS and citrate synthase) and also reduced the activity of the enzyme CPT-1 (lipolysis), wich hight activity is related to M2. These effects were accompanied by an increase in pro-inflammatory cytokines. In the inflammatory environment (LPS) the concentration of 10 nM of the toxin promoted a concomitant positive marking of both M1 and M2 markers. Also, at 100 nM CTX promoted parallel release of pro- and anti-inflammatory cytokines. Taken together, the results allow us to state that CTX modulates functions and bioenergetic pathways of human macrophages, depending on the concentration used and the microenvironment stimulus involved.

Os macrófagos (MØ) são células com alta plasticidade que podem ser reprogramados em dois fenótipos distintos – MØ M1 (pró-inflamatórios) e MØ M2 (pró-resolutivos) – de acordo com a natureza do distúrbio detectado no organismo. Experimentalmente, já é possível induzir a reprogramação de macrófagos a M1 e M2 e o estado funcional e metabólico de ambos os fenótipos já foram caracterizados. Estudos prévios de nosso grupo demostraram que a Crotoxina (CTX) exerce em macrófagos duas ações que os tornam aplicáveis em terapia celular: 1) altera seu perfil metabólico e funcional e 2) estes efeitos são de longa duração. Tais efeitos são observados após uma única e curta exposição à toxina. Neste contexto, esta pesquisa buscou caracterizar o metabolismo e o estado funcional de MØ tratados com diferentes concentrações de CTX, com o objetivo de verificar se em cada concentração é possível identificar fenótipos distintos e intermediários aos perfis M1 e M2 já descritos, para assim buscar reprogramar essas células de acordo com processos fisiopatológicos específicos. A capacidade de reprogramação fenotípica de monócitos induzida pela CTX foi avaliada em ensaios in vitro, utilizando células da linhagem monocítica humana (THP-1), incubadas previamente com meio RPMI (controle), ou LPS (1ug/mL) ou meio condicionado tumoral de MCF-7 (MCT) por 48 horas. Posteriormente, elas foram incubadas na ausência (controle) ou presença de CTX em diferentes concentrações (2 nM; 10 nM; 50 nM e 100 nM) ao longo de 1 hora. Após os diferentes protocolos de incubação com a toxina foram analisados os marcadores de diferenciação e de fenótipos, por meio da técnica de qPCR, sendo que os últimos também foram analisados por meio de citometria de fluxo. Para avaliar os efeitos dos tratamentos sobre as funções celulares, foram analisadas a capacidade de fagocitose, a geração de espécies reativas de oxigênio (H2O2) e a produção de citocinas pelos MØ. O metabolismo celular foi avaliado por meio da expressão gênica e atividade das enzimas chave da via glicolítica. Os dados apresentados evidenciam que células THP-1 são satisfatoriamente diferenciadas por LPS (1 µg/mL) e meio condicionado tumoral-MCT (Vol. obtido de 1x106 /mL) e essas células têm suas funções moduladas distintamente pela CTX, a depender da concentração utilizada. A CTX acarretou ação dual sobre as funções destes macrófagos humanos, uma vez que induziu inibição da atividade de fagocitose, ao mesmo tempo que estimulou a produção de H2O2 em células controle. Porém, esses efeitos mudam dependendo dos estímulos do microambiente, já que, em contexto tumoral e inflamatório a fagocitose foi preservada de modo concentração-dependente, acompanhada do aumento da liberação de H2O2 em algumas concentrações. Em relação às vias metabólicas, as células THP-1 não diferenciadas não apresentaram alteração na expressão gênica de nenhuma das enzimas glicolíticas avaliadas, sob o efeito de quaisquer concentrações da CTX, sugerindo que a toxina não modula a expressão dessas enzimas na célula THP-1 na condição de monócito. Porém, quando estimuladas por LPS e MCT a CTX modulou a expressão gênica de algumas enzimas: a concentração de 50 nM aumentou a expressão de enzimas de vias metabólicas que estão mais ativas em M1 (PFK, FAS e citrato sintase) e ainda reduziu a atividade da enzima CPT-1 (lipólise), cuja alta atividade está relacionada ao perfil M2. Estes efeitos foram acompanhados do aumento de citocinas pró-inflamatórias. No ambiente inflamatório (LPS) a concentração de 10 nM da toxina promoveu a marcação positiva concomitante de marcadores tanto de M1 quanto de M2. Já em 100 nM a CTX promoveu liberação paralela de citocinas pró- e anti-inflamatórias. Reunidos, os resultados nos permitem afirmar que a CTX modula funções e as vias bioenergéticas de macrófagos humanos, dependendo da concentração utilizada e do estímulo de microambiente envolvido.

Caracterização de adaptações do repertório molecular de serpentes das tribos Xenodontini e Pseudoboini relacionadas à sua ecologia de predação

Among the wide spectrum of food ecologies, some groups of snakes have become ophiophagous, feeding mainly on other snakes. Due to the relationship between diet and venom composition, these ophiophagous groups probably needed to develop specific toxins targeting snakes and some type of resistance to the venoms of the snakes they preyed on, associating these characteristics with the development of ophiophagy. In the Neotropics, more precisely in the Dipsadidae family, there are several ophiophagous species. The genus Erythrolamprus (Tribe Xenodontini) and the genera Clelia and Boiruna (Tribe Pseudoboini) contain species that are specialists in snakes. However, due to their relatively low medical relevance, they have been poorly studied and there is scarce information about their venoms and possible resistance factors or mechanisms. In the present work, the toxin composition of the venom gland transcriptome of 8 genera and 19 species of the tribe Pseudoboini and 3 genera and 8 species of the tribe Xenodontini was analyzed. In addition to being the first compositional analysis of the venom of the two tribes, a new type of enzymatic toxins exclusive to the Dipsadidae family (the svMMPs) was identified and characterized in the analyzed samples, as well as high expression levels of a type of phospholipases A2 in some species of the Pseudoboini tribe was detected. On the other hand, comparisons between liver transcriptomes and plasma proteomes of ophiophagous and non-ophiophagous species of the tribe Pseudoboini allowed identifying high expression levels of several types of toxin inhibitors. However, the occurrence of overexpression of these inhibitors in ophiophagous species was not detected. The analyzes revealed, in a broad scale, the evolutionary novelties present in the compositional profile of the venoms of the two tribes and verified the occurrence of plasma toxin inhibitors in the analyzed species.

Dentre o amplo espectro de ecologias alimentares, alguns grupos de serpentes tornaram-se ofiófagos, alimentando-se principalmente de outras serpentes. Devido à relação entre a dieta e a composição do veneno, esses grupos ofiófagos provavelmente precisaram desenvolver toxinas específicas para serpentes e algum tipo de resistência aos venenos das serpentes que predavam, associando essas características ao desenvolvimento da ofiofagia. Nos neotrópicos, mais precisamente na família Dipsadidae, ocorrem diversas espécies ofiófagas. O gênero Erythrolamprus (Tribo Xenodontini) e os gêneros Clelia e Boiruna (Tribo Pseudoboini) contêm espécies especialistas em serpentes. No entanto, devido à sua relevância médica relativamente baixa, foram pouco estudados e existem poucas informações sobre seus venenos e possíveis fatores ou mecanismos de resistência. No presente trabalho foi analisada a composição de toxinas do transcriptoma da glândula de veneno de 8 gêneros e 19 espécies da tribo Pseudoboini e de 3 gêneros e 8 espécies da tribo Xenodontini. Além de ser a primeira análise composicional do veneno das duas tribos, permitiu a identificação e caracterização de um novo tipo de toxinas enzimáticas exclusivo da família Dipsadidae (as svMMPs), assim como revelou níveis de expressão elevados de um tipo de fosfolipases A2 em algumas espécies da tribo Pseudoboini. Por outro lado, as comparações entre os transcriptomas do fígado e os proteomas do plasma de espécies ofiófagas e não ofiófagas da tribo Pseudoboini indicaram níveis de expressão elevados de vários tipos de inibidores de toxinas. Porém, não foi detectada a ocorrência de sobre expressão destes inibidores nas espécies ofiófagas. As análises revelaram, em escala abrangente, as novidades evolutivas presentes no perfil composicional dos venenos das duas tribos e verificaram a ocorrência de inibidores de toxinas plasmáticos nas espécies analisadas.

Soroterapia escorpiônica na gestação e seus efeitos na prole de ratos

Tityus serrulatus is the most venomous scorpion in Brazil. Little is known about the effects of maternal exposure to venom and serum therapy on fetal development. The effect of moderate doses of venom (4mg/kg s.c.) on the second (GD2) or tenth (GD10) day of pregnancy in pregnant rats and their offspring was investigated, as well as the effect of serum therapy (2 doses of 0.2ml i.p.). The females were evaluated for their weight gain, reproductive and dietary parameters. GD2 and GD10 females exposed to the venom showed an increase in water intake, indicating physiological changes in these females, due to the direct or indirect action of the venom on their bodies. In the pups, their weights and respective organs (placenta, kidneys, liver, heart and lungs), number of live or dead pups and visceral and skeletal abnormalities on the 21st gestational day were observed. Pups of females exposed to the venom in GD2 showed a decrease in the weight of the placentas in relation to the groups that were not exposed, while in GD10 there was a decrease in the weight of the pups and their organs in relation to the groups that were not exposed, indicating that the exposure to T. serrulatus venom results in alterations in the development of rat pups during the gestational period. The group poisoned and treated with serum showed no changes, indicating that the serum was somehow able to neutralize the effects caused by the venom. In addition, the group treated both in GD2 and in GD10 with serum alone showed almost no change, except for an increase in the heart weight of pups in GD2. All these data show advantages of serum therapy during pregnancy, nullifying the deleterious effects of exposure to venom during the prenatal period.

Tityus serrulatus é o escorpião mais peçonhento do Brasil. Pouco se sabe dos efeitos da exposição materna à peçonha e à soroterapia no desenvolvimento fetal. Investigou-se o efeito de doses moderadas da peçonha (4mg/kg s.c.) no segundo (GD2) ou décimo (GD10) dia da gestação em ratas prenhes e seus filhotes, bem como o efeito do tratamento soroterápico (2 doses de 0,2ml i.p.). As fêmeas foram avaliadas quanto a seu ganho de massa, parâmetros reprodutivos e dieta. Fêmeas de GD2 e GD10 expostas à peçonha apresentaram aumento na ingestão de água, indicando alterações fisiológicas destas fêmeas, devido à ação direta ou indireta da peçonha em seus organismos. Nos filhotes foram observados suas massas e respectivos órgãos (placenta, rins, fígado, coração e pulmão), número de filhotes vivos ou mortos e anomalias viscerais e esqueléticas no dia 21 gestacional. Filhotes de fêmeas expostas à peçonha em GD2 apresentaram diminuição na massa das placentas em relação aos grupos que não foram expostos, enquanto em GD10 observou-se diminuição da massa dos filhotes e de seus órgãos em relação aos grupos que não foram expostos, indicando que a exposição à peçonha de T. serrulatus resulta em alterações no desenvolvimento de filhotes de ratas no período gestacional. O grupo envenenado e tratado com soro não apresentou mudanças significativas, indicando que o soro de certa forma foi capaz de neutralizar os efeitos causados pela peçonha. Além disso, tanto em GD2 quanto em GD10 o grupo tratado somente com o soro não apresentou quase nenhuma alteração, salvo aumento da massa do coração de filhotes em GD2. Todos estes dados indicam vantagens do tratamento soroterápico, podendo anular os efeitos deletérios da exposição à peçonha no período pré-natal.

Estudo comparativo da fração de baixa massa molecular de venenos viperídeos do Brasil e de outros locais

Snakebites were classified by WHO as neglected diseases, and the study of venom content from snakes that cause accidents is very important and has a great impact on public health. Venomics comprises a set of analytical techniques that allows the study of the toxins present in the venom, understanding their structures and their biological functions and evolutionary relationships. However, when it comes to low mass molecules little is known about this fraction due to the lack of effective approaches for their study. Thus, the present study aimed to apply different methods of preparation and separation for the study of low mass molecules (<10kDa), to suggest alternatives for a better characterization of this little explored fraction. Viperidae of different species/genus and biomes were processed by ultrafiltration and subjected to hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC), mass spectrometry and antimicrobial activity screening. This is the first work to use the HILIC method for low molecular mass characterization of snake venoms, which showed better separation and molecular diversity than the classical RP-HPLC method. The fractions showed similar chromatographic profiles for snakes of the same genus, but genus-specific features were also detected. Mass spectrometry analyses revealed the presence of canonical BPPs, new peptides, and protein fragments (possible cryptides), after HILIC fractionation. the low molecular fractions from Agkistrodon bilineatus, Bitis gabonica, Bitis arietans and Bitis nasicornis showed antimicrobial activities against bacteria and fungi. In summary, the present study shows that HILIC is an efficient approach for the biochemical characterization of low mass molecules showing relevant biological activities from snake venoms, that could also be a new source of candidate-molecules with pharmacological potential.

Os acidentes ofídicos foram classificados pela OMS (Organização Mundial da Saúde) como doenças negligenciadas, e o estudo do conteúdo das peçonhas de serpentes que causam acidentes são muito importantes e tem grande impacto na saúde pública. A venômica compreende um conjunto de técnicas analíticas que permitem o estudo das toxinas presentes na peçonha, compreendendo suas estruturas, funções biológicas e relações evolutivas. No entanto, quando se trata de moléculas de baixa massa pouco se sabe sobre esta fração devido à falta de abordagens eficientes para o seu estudo. Assim, o presente estudo teve como objetivo aplicar diferentes métodos de preparação e separação para o estudo de moléculas de baixa massa (<10kDa), para sugerir alternativas para uma melhor caracterização desta fração pouco explorada. Viperídeos de diferentes espécies/gêneros e biomas (N=10) foram processados por ultrafiltração e submetidos a cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC), espectrometria de massas e triagem de atividade antimicrobiana. Este é o primeiro trabalho a utilizar o método HILIC para caracterização de baixa massa molecular de peçonhas de serpentes, que apresentou melhor separação e diversidade molecular do que o método clássico de RP-HPLC. As frações apresentaram perfis cromatográficos semelhantes para serpentes do mesmo gênero, mas características específicas de gênero também foram detectadas. Análises de espectrometria de massa revelaram a presença de BPPs canônicos, novos peptídeos e fragmentos de proteínas (possíveis criptídeos), após fracionamento HILIC. as frações de baixo peso molecular de Agkistrodon bilineatus, Bitis gabonica, Bitis arietans e Bitis nasicornis apresentaram atividade antimicrobiana contra bactérias e fungos. Em resumo, o presente estudo mostra que HILIC é uma abordagem eficiente para a caracterização bioquímica de moléculas de baixa massa e que essa fração pode ser uma nova fonte de moléculas candidatas com potencial farmacológico.

Papel do sistema complemento na inflamação induzida pelo veneno da serpente Bothrops jararaca

The genus Bothrops, family Viperidae, integrates a group of snakes with more than 30 species and subspecies, widely distributed in the neotropical region, occurring from southern Mexico to northern Argentina and some islands of the Caribbean. In Brazil, in 2021, they were responsible for around 70% of the more than 29,000 snakebites registered. The snake venom of this genus has a wide repertoire of molecules in its composition, such as metalloproteases, serineproteases, type C lectin, bradykininenhancing peptides (BPPs), among others. The clinical manifestations of the envenomation are complex and characterized by prominent local effects, including pain, edema, ecchymosis, blisters, abscesses and necrosis, which can progress to tissue loss, physical disability or amputation. Systemic signs can also occur, such as hemorrhage, coagulopathy, shock, and acute kidney failure. Parenteral administration of commercial polyvalent antivenom is the only scientifically validated therapeutic tool for the treatment of snakebites. However, despite the effective neutralization of the systemic effects, this treatment is still ineffective in reversing local clinical manifestations. The rapid development of local clinical manifestations is accompanied by the presence of mediators of the inflammatory process, originated from tissues damaged by the bothropic venom. Studies from our group have shown that the Bothrops jararaca venom is able to activate the complement system, suggesting that this activation may contribute to the symptoms observed in these envenomations. Considering the important role that the complement system plays in the inflammatory response, this study aimed to analyze the action of B. jararaca snake venom on the complement system and cell surface receptors involved in innate immunity. For this, we used the ex-vivo human whole blood model proposed by Mollnes et al. (2002) and recently adapted by Johnson et al. (2018). With this model, by means of immunoassays, it was evaluated the complement system activation: from the generation of anaphylatoxins and soluble terminal complement complex (sTCC /SC5b-9); the production of cytokines (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70 e TNF-α) and chemokines (IL-8, IP-10, MCP-1, MIG, RANTES); the expression of leukocyte receptors such as TLRs 2 and 4; CD14; CD11b; C3aR and C5aR; the modulation of these parameters by the use of specific inhibitors of the complement system (Cp40, PMX205). The B. jararaca venom was able to induce activation of the complement system in the human whole blood model, generating a significant increase in the production of anaphylatoxins C3a/C3a-desArg, C4a/C4a-desArg, C5a/C5a-desArg and sTCC. In leukocytes, the venom of B. jararaca induced increased expression of TLR2 and reduced expression of C5aR. The expression of CD11b, CD14, C3aR and TLR4 was not altered by the action of the venom. Inhibition of the C3 component by Cp40 resulted in a reduction to basal levels of C3a/C3a-desArg and sTCC in samples stimulated with the venom. Cp40 also caused a significant reduction in the levels of C5a/C5a-desArg, but not of C4a/C4a-desArg. Exposure to B. jararaca venom induced the production of inflammatory cytokines and chemokines such as TNF-α, IL-8, MCP1 and MIG in the human whole blood model. Treatment with Cp40 promoted a significant reduction in the production of TNF-α, IL-8 and MCP-1. The use of the C5a receptor 1 antagonist, PMX205, promoted a reduction to basal levels of TNF-α and IL8 in samples stimulated with venom. In conclusion, the data presented here suggest that the activation of the complement system, promoted by the venom of the snake B. jararaca in the human whole blood model, significantly contributes to the inflammatory process. The control of several inflammatory parameters by Cp40, an inhibitor of the C3 component, and of PMX205, a C5a receptor 1 antagonist, indicate that complement inhibition may be a possible therapeutic tool in B. jararaca envenomation.

O gênero Bothrops, família Viperidae, integra um grupo de serpentes com mais de 30 espécies e subespécies, amplamente distribuídas na região neotropical, ocorrendo desde o Sul do México até o norte da Argentina e em algumas ilhas do Caribe. No Brasil, em 2021, foram responsáveis por cerca de 70% dos mais de 29.000 acidentes ofídicos registrados. O veneno das serpentes deste gênero possui amplo repertório de moléculas em sua composição, como metaloproteases, serinoproteases, lectina do tipo C, peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs), entre outras. As manifestações clínicas do envenenamento são complexas e caracterizadas por efeitos locais proeminentes, incluindo dor, edema, equimose, bolhas, abcessos e necrose, que podem evoluir para perda tecidual, incapacidade física ou amputação. Sinais sistêmicos também podem ocorrer, tais como hemorragia, coagulopatia, choque e insuficiência renal aguda. A administração parenteral do antiveneno polivalente comercial constitui o único recurso terapêutico cientificamente validado para o tratamento dos acidentes ofídicos. Contudo, apesar da efetiva neutralização dos efeitos sistêmicos, esse tratamento ainda se mostra ineficiente na reversão das manifestações clínicas locais. O rápido desenvolvimento das manifestações clínicas locais é acompanhado pela presença de mediadores do processo inflamatório, originados a partir de tecidos lesados pelo veneno botrópico. Estudos do nosso grupo mostraram que o veneno da Bothrops jararaca é capaz de ativar o sistema complemento, sugerindo que essa ativação possa contribuir para os sintomas observados nesses envenenamentos. Considerando o importante papel que o sistema complemento desempenha na reposta inflamatória, o presente estudo teve como objetivo analisar a ação do veneno da serpente B. jararaca sobre o sistema complemento e receptores de superfície celular envolvidos na imunidade inata. Para isto, utilizamos o modelo ex-vivo de sangue total humano, proposto por Mollnes e colaboradores (2002) e, recentemente, adaptado por Johnson e colaboradores (2018). Com este modelo, por meio de imunoensaios, foram avaliadas a ativação do sistema complemento: a partir da geração de anafilatoxinas e complexo terminal do complemento solúvel (sTCC /SC5b-9); produção de citocinas (IL-1β, IL-6, IL-10, IL12p70 e TNF-α) e quimiocinas (IL-8, IP-10, MCP-1, MIG, RANTES); expressão de receptores de leucócitos, como TLRs 2 e 4; CD14; CD11b; C3aR e C5aR; modulação destes parâmetros pelo uso de inibidores específicos do sistema complemento (Cp40, PMX205). O veneno da B. jararaca foi capaz de induzir ativação do sistema complemento no modelo de sangue total humano, gerando aumento significativo na produção das anafilatoxinas C3a/C3a-desArg, C4a/C4a-desArg, C5a/C5a-desArg e sTCC. Nos leucócitos, o veneno da B. jararaca induziu aumento da expressão de TLR2 e redução da expressão de C5aR. A expressão de CD11b, CD14, C3aR e TLR4 não foi alterada pela ação do veneno. A inibição do componente C3 pelo Cp40 resultou na redução para níveis basais de C3a/C3a-desArg e do sTCC nas amostras estimuladas com o veneno. O Cp40 também causou uma redução significativa nos níveis de C5a/C5a-desArg, mas não de C4a/C4a-desArg. A exposição ao veneno da B. jararaca induziu a produção de citocinas e quimiocinas inflamatórias como TNF-α, IL-8, MCP-1 e MIG no modelo de sangue total humano. O tratamento com Cp40 promoveu uma redução significativa na produção de TNF-α, IL- 8 e MCP-1. O uso do antagonista do receptor 1 de C5a, PMX205, promoveu redução para níveis basais de TNF-α e IL-8 em amostras estimuladas com veneno. Em conclusão, os dados aqui apresentados sugerem que a ativação do sistema complemento, promovida pelo veneno da serpente B. jararaca no modelo de sangue total humano, contribui significativamente para o processo inflamatório. O controle de vários parâmetros inflamatórios pelo uso do Cp40, inibidor do componente C3, e do PMX205, antagonista do receptor 1 de C5a, indicam que a inibição do complemento possa ser uma possível ferramenta terapêutica no envenenamento por B. jararaca.

Participação da aldeído desidrogenase-2 na neuroinflamação induzida pela constrição do nervo isquiático

Background: Aldehyde dehydrogenase-2 (ALDH2) is a mitochondrial enzyme responsible for detoxifying aldehydes generated from the lipid peroxidation. We previously showed that Alda-1, a small molecule that activates ALDH2, has a potent antinociceptive effect in a chronic neuropathic pain model induced by the chronic constriction injury of the sciatic nerve (CCI) in mice, by decreasing reactive aldehydes, such as 4-hydroxynonenal (4-HNE) at the injured site. One of the most important mechanisms involved in the neuropathic pain onset and chronification is the activation of immune and glial cells. Considering that reactive aldehydes are pro- inflammatory and pro-nociceptive, we hypothesized that 4-HNE is involved in the central sensitization in CCI-induced neuropathy model. Methods: The nociceptive threshold was assessed by the up and down method using von Frey filaments, before (0), 7-, and 14-days post-injury (DPI). The ALDH2 function was modulated by Alda-1 (16 mg/Kg/day, s.c. osmotic pump) or by using a transgenic mice model with an inactivating mutation found commonly in Asiatic populations that impairs ~95% in ALDH2 activity (ALDH2*2). The 4-HNE protein adducts and the activation of glial cells in the dorsal horn of the spinal cord was assessed by using immunofluorescence techniques, followed by microglia morphology, and co- localization analysis. Moreover, axonal degeneration was assessed by evaluating the cell infiltration and fragmentation of myelin in histological preparation of sciatic nerve. Results: CCI decreases the nociceptive threshold in 7 and 14DPI, in wildtype (WT) and ALDH2*2 animals, and Alda-1 prevents CCI-induced hypernociception in both periods and genotypes. Also, CCI increases the immunostaining for 4-HNE adducts, GFAP (astrocyte), Iba-1 (microglia) along with a change in microglia morphology to pro-inflammatory profile in wild type mice. Alda-1 prevents 4-HNE adducts formation and glial cells activation, as measured in microglia morphology. Interestingly, the impairment in ALDH2 activity contributes to changes in glial activation dynamic. Alda- 1 reduces 4-HNE levels in ALDH2*2 mice, without interfering with IBA-1 and GFAP expressions. However, the microglia morphology analysis revealed that Alda-1 might induce a shift from inflammatory to anti-inflammatory profile. The co-localization study showed that 4-HNE accumulates in afferent axons, Schwann cells, as well as spinal cord neurons and oligodendrocytes. Finally, we also showed that CCI induced sciatic nerve degeneration in both genotypes, which was prevented by the treatment with Alda-1. Conclusion: The data suggest that 4-HNE plays an important role in neuropathic hypernociception by controlling aldehyde levels and central neuroinflammation, as well as regulates axonal degeneration and peripheral inflammation in this model. Interestingly, the genetic impairment in ALDH2 activity changes the dynamics of glial activation upon nerve injury. Finally, Alda-1 is a promising molecule for neuropathic pain treatment.

A aldeído desidrogenase-2 (ALDH2) é uma enzima mitocondrial responsável pela detoxicação de aldeídos gerados a partir da peroxidação lipídica. Mostramos anteriormente que a Alda-1, uma pequena molécula ativadora a ALDH2, inibe a hipernocicepção em um modelo de dor neuropática induzida pela constrição crônica do nervo isquiático (CCI) em camundongos, por levar a diminuição de aldeídos reativos, como 4-hidroxinonenal (4-HNE) no local lesionado. Sabe-se que um dos principais mecanismos envolvidos na instalação e na cronificação da dor neuropática é a sensibilização central e periférica, que ocorre por ativação de células imunes e gliais. Considerando que os aldeídos reativos são pró-inflamatórios e pró- nociceptivos, levantamos a hipótese que o 4-HNE participa dos processos de sensibilização central e periférica no modelo de neuropatia induzida por CCI. Métodos: O limiar nociceptivo foi determinado pelo método up and down por meio de filamentos de von Frey, que foi aplicado antes (0), 7 e 14 dias após a cirurgia. A função da ALDH2 foi modulada pelo tratamento com a Alda-1 (16 mg/Kg/dia, s.c. por bomba osmótica), ou por meio de camundongos transgênicos contendo uma mutação encontrada em populações asiáticas que reduz (~ 95%) a atividade de ALDH2 (ALDH2*2). A análise dos níveis de adutos de 4-HNE, ativação de células imunes e gliais e liberação de citocinas foram avaliados por meio de western blot, imunofluorescência e ensaio de multiplex, respectivamente. Ainda, a degeneração axonal foi determinada pela infiltração celular e fragmentação de mielina no preparo histológico do nervo isquiático. Resultados: a CCI diminui o limiar nociceptivo em 7 e 14 dias após a cirurgia, em animais selvagens (WT) e ALDH2*2. A administração de Alda-1 previne a hipernocicepção induzida pela CCI em ambos os períodos e genótipos. Adicionalmente, demonstramos que a CCI aumenta a imunomarcação para adutos de 4-HNE, GFAP (astrócitos), Iba-1 (microglia), juntamente com uma mudança na morfologia da micróglia para um perfil pró-inflamatório, no corno dorsal da medula espinal de animais selvagens. A Alda-1 previne o aumento nos níveis de 4-HNE e na ativação de células gliais. Curiosamente, o prejuízo na atividade da ALDH2 contribui para mudanças na dinâmica de ativação glial, já que a Alda-1 reduz os níveis de 4-HNE em camundongos ALDH2*2, sem interferir nas expressões de IBA-1 e GFAP. No entanto, a análise da morfologia da micróglia revelou que Alda-1 pode induzir uma mudança para um perfil anti-inflamatório. O estudo de co- localização mostrou que o 4-HNE se acumula em axônios aferentes, células de Schwann e macrófagos na periferia, bem como neurônios e oligodendrócitos da medula espinal. Por fim, também mostramos que a CCI induziu degeneração do nervo isquiático em ambos os genótipos, que foi prevenida pelo tratamento com Alda-1. Conclusão: Os dados sugerem que o 4-HNE desempenha um papel importante na hipernocicepção neuropática controlando os níveis de aldeídos e a neuroinflamação central, bem como regula a degeneração axonal e a inflamação periférica neste modelo. Curiosamente, o comprometimento genético na atividade da ALDH2 altera a dinâmica da ativação glial frente à lesão do nervo. Finalmente, a Alda-1 é uma molécula promissora para o tratamento da dor neuropática.

Análise proteômica dos efeitos cardiotóxicos da peçonha de Crotalus durissus terrificus

Todo ano, aproximadamente 2,7 milhões de indivíduos são mordidos por serpentes peçonhentas em todo o mundo. Dentre eles, são reportados cerca de 490.000 amputações e 130.000 óbitos bem como outros problemas graves de saúde resultante da mordida por serpentes. No Brasil, a serpente Crotalus durissus popularmente conhecida como cascavel é a única espécie do gênero Crotalus representada em todo o território. Essa serpente é a mais letal e a segunda maior responsável pelos acidentes na população. A subespécie Crotalus durissus terrificus é encontrada predominantemente nas regiões Sul e Sudeste do país e possui uma peçonha conhecida por apresentar efeitos neurotóxicos, nefrotóxicos, miotóxicos, cardiotóxicos e por causar distúrbios hemolíticos e quadros de coagulopatias. Na literatura são encontrados muitos relatos que descrevem os aspectos patológicos, clínicos, toxicológicos, fisiológicos e bioquímicos dos efeitos do envenenamento em vários órgãos, contudo existem poucos registros descrevendo o efeito do envenenamento a nível molecular. Dessa forma, neste projeto foram avaliados os efeitos da peçonha da serpente C. d. terrificus no coração de camundongos de linhagem Swiss 1 h, 6 h, 12 h e 24 h após a aplicação de 0,5 DL50 da peçonha no músculo gastrocnêmio. O coração dos animais foi dissecado e lisado com tampão PTS. As proteínas cardíacas foram então extraídas, modificadas quimicamente (reduzidas e alquiladas), digeridas com tripsina e os peptídeos trípticos resultantes foram marcados com formaldeído leve (grupo controle) e pesado (grupo tratado com a peçonha) e submetidos à análise por espectrometria de massas de alta resolução. Foram identificadas mais de 1300 proteínas das quais várias delas apresentaram alterações no perfil quantitativo ao longo do tempo após o tratamento com a peçonha. A análise do perfil proteico mostrou os efeitos tóxicos da peçonha no coração do camundongo modulando várias proteínas associadas às mitocôndrias e relacionadas com cardiomiopatias hipertrófica e dilatada. As mudanças na abundância dessas proteínas sugerem como elas podem atuar sinergicamente sobre um quadro de envenenamento no tecido cardíaco por meio de distintos efeitos imunológicos e bioquímicos

Every year, approximately 2.7 million individuals are bitten by venomous snakes worldwide. Among them, about 490,000 amputations and 130,000 deaths are reported, as well as other serious health problems resulting from snake bites. In Brazil, Crotalus durissus, popularly known as rattlesnake is the only species of the Crotalus genus found in the entire country. This snake is the most lethal and the second most responsible for accidents in the population. Crotalus durissus terrificus is found predominantly in the South and Southeast of Brazil. Its venom is known for presenting neurotoxic, nephrotoxic, myotoxic and cardiotoxic effects and for causing hemolytic disorders and coagulopathies. Several reports in the literature describe the pathological, clinical, toxicological, physiological, and biochemical aspects of the effects of the envenomation in various organs, however there are few works describing the effect of the venom at the molecular level. In this project, we analyzed the effects of the C. d. terrificus snake venom in the heart of mice of the Swiss strain at 1 h, 6 h, 12 h and 24 h, after the application of 0.5 DL50 of the venom in the gastrocnemius muscle. The animals' hearts were dissected and lysed with PTS buffer. Cardiac proteins were extracted, chemically modified (reduced and alkylated), digested with trypsin and the resulting tryptic peptides were labeled with light (control group) and heavy (venom treated group) dimethyl reagent and subjected to high-resolution mass spectrometry analysis. More than 1300 proteins were identified, several of them showed changes in the quantitative profile over the time after the venom treatment. The venom modulated several proteins associated with mitochondria and related to hypertrophic and dilated cardiomyopathies. Changes in the protein abundance suggests how proteins act synergistically upon envenomation in cardiac tissue, through distinct immunological and biochemical effects.

Reação inflamatória induzida por duas SVMPs isoladas do veneno de Bothrops atrox e por fragmentos peptídicos gerados da hidrólise de componentes da membrana basal por estas enzimas / Inflammatory reaction induced by two metalloproteinases isolated from Bothrops atrox venom and by fragments generated from the hydrolysis of basement membrane components

Snake venom metalloproteases (SVMPs) are key toxins in local and systemic effects observed in victims of snakebites. The mechanisms involved in SVMPs action are related to the hydrolysis of blood vessels basement membrane components (BM), well as their direct action on platelets, endothelial and inflammatory cell receptors, and coagulation factors. Some evidence suggests that endogenous factors derived from BM hydrolysis increase the local effects induced by SVMPs and, consequently, the severity of snakebites. In this study we evaluated the role of two SVMPs of class P-I and P-III named Atroxlysin-Ia (ATXL) and Batroxrhagin (BATXH), respectively, isolated from the Bothrops atrox venom, and its hydrolysis products on Matrigel in experimental models of inflammation. Both toxins induced inflammatory reactions in mice models. The edema formed in the mice paws after the injection of different doses of SVMPs did not indicate a statistical difference between the tested doses or between the toxins. The lesions were similar despite the ATXL having a lower molecular mass than BATXH. In the kinetics tests of edema and accumulation of peritoneal leukocytes, a dose of 2 µg / animal was used. Both toxins induced the formation of an edema peak between 30 min and 1 h, with a 70% increase in the size of the paws. ATXL and BATXH induced an increase in leukocyte influx 4 h after intraperitoneal injection. For the evaluation of possible inflammatory mediators involved in these reactions, we stimulated Murine Peritoneal Adherent Cells (MPACs) with 40 µg / mL of the SVMPs or B. atrox venom in different time´s period. The cytokine TNF-α was identified in the supernatant of cells stimulated with BATXH or with B. atrox. The venom peaked between 2 h and 6 h with levels of 800 pg/mL, and BATXH induces secretion of 200 pg/mL in 4 h. The same was not observed with ATXL. To test the hypothesis that peptides resulting from MB hydrolysis by SVMPs could participate in the inflammatory process, Matrigel was incubated with the toxins for 1 h at 37 ° C, and the hydrolysis products were identified by LC-MS/MS. In parallel, peptides resulting from this incubation were isolated on centrifugal filters with a 10 kDa cut off. The reaction generated different fragments, mainly Laminin peptides. Isolated peptides in the filters induced the formation of edema with a 30% increase in the size of the paws and promoted leukocyte accumulation in the peritoneal cavity (4-5 x 106 cells/mL). Thus, the results suggest that ATXL and BATXH, together with peptides resulting from Matrigel´s hydrolysis, play an important role in inflammatory reaction observed in envenoming by B. atrox. Generally, envenoming causes irreversible local injuries, even after the administration of antivenom. In this context, we present tests with two inhibitors derived from the Jararhagin pro-domain that were able to neutralize the catalytic, fibrinolytic and hemorrhagic activity induced by SVMP, indicating a possible complementary treatment with antibotropic serum.

Metaloproteases do veneno de serpentes (SVMPs) são toxinas chave nos efeitos locais e sistêmicos observados em vítimas de acidentes ofídicos. Os mecanismos envolvidos na ação das SVMPs estão relacionados à hidrólise dos componentes da membrana basal (MB) dos vasos sanguíneos, bem como à sua ação direta sobre plaquetas, receptores de células endoteliais e inflamatórias, e fatores de coagulação. Algumas evidências sugerem que fatores endógenos derivados da hidrólise de MB aumentam os efeitos locais induzidos pelas SVMPs e, consequentemente, a gravidade dos acidentes ofídicos. Neste trabalho avaliamos o papel de duas SVMPs de classe P-I e P-III nomeadas Atroxlisina-Ia (ATXL) e Batroxragina (BATXH), respectivamente, isoladas do veneno de Bothrops atrox, e seus produtos de hidrólise sobre o Matrigel em modelos experimentais de inflamação. As duas toxinas induziram reação inflamatória em modelos murinos. O edema formado nas patas de camundongos após a injeção de diferentes doses das SVMPs não indicou diferença estatística entre as doses testadas nem entre as toxinas. As lesões foram semelhantes apesar da ATXL possuir massa molecular menor que BATXH. Nos testes de cinética do edema e acúmulo de leucócitos peritoneais foi utilizada a dose de 2 µg/animal. Ambas as toxinas induziram a formação de um pico de edema entre 30 min e 1 h, com aumento de 70% no tamanho das patas. ATXL e BATXH induziram aumento do influxo leucocitário a partir de 4 h após injeção intraperitoneal. Para a avaliação de possíveis mediadores inflamatórios envolvidos nestas reações, estimulamos Células Aderentes Peritoneais Murinas (MPACs) com 40 µg/mL das SVMPs ou veneno de B. atrox em diferentes períodos de tempo. A citocina TNF-α foi identificada no sobrenadante de células estimuladas com BATXH ou com veneno de B. atrox. O veneno atingiu um pico entre 2 h e 6 h com níveis de 800 pg/mL, e BATXH induziu secreção de 200 pg/mL em 4 h. O mesmo não foi observado com ATXL. Para testar a hipótese de que os peptídeos resultantes da hidrólise de MB pelas SVMPs poderiam participar do processo inflamatório, Matrigel foi incubado com as toxinas durante 1 h a 37 °C, e os produtos de hidrólise foram identificados por LC-MS/MS. Paralelamente, peptídeos resultantes desta incubação foram isolados em filtros centrífugos com corte de 10 kDa. A reação gerou diferentes fragmentos, principalmente peptídeos da Laminina. Peptídeos isolados por filtração induziram a formação de edema com aumento no tamanho das patas de 30%, e promoveram o acúmulo leucocitário na cavidade peritoneal (4-5 x 106 células/mL). Assim, os resultados sugerem que ATXL e BATXH, juntamente com peptídeos resultantes da hidrólise do Matrigel por essas proteases desempenham um papel importante na reação inflamatória observada no envenenamento por B. atrox. Geralmente, o envenenamento causa lesões locais irreversíveis, mesmo após a administração do antiveneneno. Neste contexto, apresentamos testes com dois inibidores derivados do pró-domínio da Jararagina que foram capazes de neutralizar a atividade catalítica, fibrinolítica e hemorrágica induzidas pela SVMP, indicando um possível tratamento complementar com soro antibotrópico.

Exenatida e exendina(9-39) oriundos do lagarto venenoso Heloderma suspectum e seus efeitos sobre a qualidade espermática de ratos obesos e diabéticos / Exenatide and exendin(9-39) from the poisonous lizard Heloderma suspectum and its effects on sperm quality in obese and diabetic rats

The effects of exenatide (EXE) and exendin(9-39) (EXE9), peptides isolated from poisonous lizard H. suspectum on obesity and diabetes mellitus on male fertility are still poorly understood. The aim of this study was to evaluate the effects of EXE and EXE9 on parameters that contribute to sperm quality in hypothalamic injury-induced obesity (MSG) and hypercaloric diet (DIO) as well as streptozotocin-induced diabetes mellitus (STZ). Obese and diabetic rats received 10μg EXE / kg or 100μg EXE9 / kg sc daily or remained untreated for 20 days. Healthy rats at same age for each experimental models were used for comparison, only MSG model used healthy rats treated with exenatide. Biometric and glucoregulatory parameters treated with EXE (STZ) and EXE9 (STZ, DIO, MSG) were evaluated. Blood, testes and tail of the epididymis were collected. Sex hormones, leptin and insulin were evaluated by ELISA. Sperm were obtained from the epididymal tail by washing with HTF culture medium. The percentage of abnormal sperm morphology was analyzed under a phase contrast microscope. Functional analyzes of sperm were performed only STZ and MSG models. Sperm kinetics was evaluated by Computer Aided Analysis. The EXE-treated STZ group (STZ-E) improved the biometric parameters, glycemic control as well as the morphology, functionality and kinetics of mature sperm and EXE9 (STZ-E9) has an EXE effect on essential parameters for maintaining sperm quality. DIO showed impaired sperm quality, but there were occasional changes in the parameters that affect sperm quality. DIO-E improved sperm quality, suggesting that the antiobesogenic, antidislipidemic, and antidiabetogenic action of EXE restored the accuracy of the pathway of mature sperm, whereas treatment with EXE9 did not dramatically affect sperm kinetics, but was unable to restore path accuracy. EXE, through glucoregulatory improvement in MSG, has beneficial effects on hormone levels as well as sperm morphology, functionality and kinetics. Negative changes caused by EXE9 in glycorregulatory parameters, exacerbated increase in mass of periepididimal adipose tissue deposition, decreased testosterone and FSH plasma levels, with consequences on kinetics negatively affect sperm quality. EXE has been shown to be an excellent therapeutic agent to be used for beneficial effects on sperm quality in obese and diabetic patients. Results of treatment with EXE9 similar to those obtained with EXE in some evaluated parameters suggest two hypotheses (1) the use of an alternative to classical receptor; or (2) a dose-dependent situation if the dose of EXE9 administered is not sufficient for its action as an antagonist in a given organ and / or tissue. Therefore clinical research is needed to deepen the knowledge as well as the use of exenatide in a new incretinomimetic function as therapy.

Os efeitos da exenatida (EXE) e da exendina(9-39) (EXE9), peptídeos isolados do lagarto venenoso H. suspectum sobre a obesidade e diabetes melito na fertilidade masculina ainda são pouco compreendidos. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da EXE e da EXE9 sobre parâmetros que contribuem para a qualidade espermática na obesidade induzida por injúria hipotalâmica (MSG) e dieta hipercalórica (DIO) bem como no diabetes melito induzido por estreptozotocina (STZ). Ratos obesos e diabéticos receberam 10μg EXE/kg ou 100μg EXE9/kg sc diariamente ou permaneceram sem tratamento por 20 dias. Ratos saudáveis de mesma idade para cada modelo experimental foram utilizados para comparação, somente para o modelo MSG houve ratos saudáveis tratados com exenatida. Foram avaliados parâmetros biométricos e glicorregulatórios tratados com EXE (STZ) e EXE9 (STZ, DIO, MSG). Sangue, testículos e cauda do epidídimo foram coletados. Hormônios sexuais, leptina e insulina foram avaliados por ELISA. Os espermatozoides foram obtidos da cauda epididimal por lavagem com meio de cultura HTF. A porcentagem de morfologia anormal dos espermatozoides foi analisada sob um microscópio de contraste de fase. Foram realizadas análises funcionais dos espermatozoides somente para os modelos STZ e MSG. A cinética espermática foi avaliada pela Análise Assistida por Computador. O grupo STZ tratado com EXE (STZ-E) melhorou os parâmetros biométricos, controle glicêmico bem como a morfologia, funcionalidade e cinética de espermatozoides maduros e EXE9 (STZ-E9) possui efeito contrário a EXE em parâmetros essenciais para manutenção da qualidade espermática. DIO apresentou comprometimento da qualidade espermática, porém foram alterações pontuais nos parâmetros que afetam a qualidade espermática. DIO-E melhorou a qualidade espermática, sugerindo que a ação antiobesogênicao, antidislipidêmico e antidiabetogênico de EXE restaurou a acurácia da trajetória do espermatozoide maduro, já o tratamento com EXE9 não afetou drasticamente a cinética espermática, mas foi incapaz de restaurar a acurácia da trajetória. EXE, através da melhora glicorregulatória em MSG, tem efeitos benéficos nos níveis hormonais, bem como na morfologia, funcionalidade e cinética dos espermatozoides. As alterações negativas causadas por EXE9 nos parâmetros glicorregulatórios, aumento exacerbado da massa do depósito de tecido adiposo periepididimal, diminuição dos níveis plasmáticos de testosterona e FSH, com consequências sobre a cinética repercutem negativamente sobre a qualidade dos espermatozoides. A EXE mostrou-se um excelente agente terapêutico para ser utilizado em busca de efeitos benéficos sobre a qualidade espermática em obesos e diabéticos. Os resultados do tratamento com EXE9 similares aos obtidos com EXE em alguns parâmetros avaliados sugerem duas hipóteses (1) a utilização de um receptor alternativo ao clássico; ou (2) uma situação dose-dependente no caso da dose de EXE9 administrada não ser o suficiente para sua ação como antagonista em determinado órgão e/ou tecido. Portanto são necessário pesquisas clínicas para aprofundar o conhecimento bem como a utilização da exenatida em uma nova função incretinomimética como terapia.

Ações da β-micrustoxina, uma fosfolipase A2 do veneno da serpente Micrurus lemniscatus, sobre a proliferação celular e a apoptose de astrócitos em cultura e os mecanismos envolvidos. / Actions of β-micrustoxin, a phospholipase A2 of the venom of the snake Micrurus lemniscatus, on cell proliferation and apoptosis of astrocytes in culture and the mechanisms involved.

Toxins that exhibit phospholipase A2 (PLA2) activity are present in snake venoms from Elapidae and Viperidae families. They are neurotoxic and act by impairing synaptic transmission from the neuromuscular junction. Although the principal target of these toxins is the neuromuscular junction, there are several studies that have used neuronal cells from central structures in order to characterize their mechanism of action and this model has proved to be very useful. In relation to glial cells, however, there are few studies showing some effect of PLA2 from animal venoms. Glial cells, astrocytes in particular, have important roles in the central and peripheral nervous system, being part of the synapses. The objective of this study was to characterize the action of the PLA2 toxin, β-micrustoxin, isolated from Micrurus lemniscatus snake venom, on cultured astrocytes, addressing cell viability, cell proliferation, cell cycle phases distribution, protein expression of p53, p27 and p21, cell senescence and mitochondrial membrane potential. Gene and protein expression of the phospholipase A2 receptor (PLA2R) was evaluated, as well as the internalization process in cultured astrocytes and hippocampal neurons. The partial toxin primary sequence was also characterized by proteolytic digestion and by comparison of the peptides acquired with data bases. Astrocytes and neurons were obtained from Wistar rats (CEUAIB – Protocolo n°1223/14) and maintained in culture in DMEM medium + 10% SFB or Neurobasal medium + B27, respectively, at 37°C, 5% CO2. Astrocytes were incubated with β–micrustoxin for several times. Cell viability was evaluated by MTT test; cell proliferation, cell cycle phases and p53, p21 and p27 proteins were evaluated by flow cytometry. Cell senescence was analyzed by β-galactosidase assay and mitochondrial potential was also analyzed by using the TMRE probe. In order to investigate the internalization process, β-micrustoxin was conjugated to Alexa 488 fluorophore and the cells observed in confocal microscopy, in normal medium and with the PLA2 activity inhibited. β-micrustoxin reduced cell viability and cell proliferation of astrocytes. The G2/M phase was augmented and does not was verified DNA fragmentation nor mitochondrial potential alteration. β-micrustoxin induced increase in the cell cycle regulatory proteins, p53, p21 and p27. β-micrustoxin conjugated with Alexa 488 internalized in astrocytes and neurons. This process is dependent on PLA2 activity in neurons, but not in astrocytes. PLA2R is expressed very acutely in astrocytes but it is also expressed in hippocampal neurons, even though in minor quantities. The data allowed to conclude that β-micrustoxin interferes in astrocytes cell proliferation, by inducing a cell cycle arrest in G2/M phase and this effect is mediated by p53, p21 and p27, without evidence of cell death. Moreover, there are evidences that β-micrustoxin would induce its effects throughout its internalization in the cell cytosol. This study contributes to a better understanding of the cell events involved in the toxicity induced by the PLA2 β-micrustoxin, isolated from the venom of the snake Micrurus lemniscatus. Besides, it opens a perspective of developing new drugs that could have inhibitory actions on cell proliferation.

Toxinas com atividade de fosfolipase A2 (FLA2) são encontradas em venenos de serpentes das famílias Elapidae e Viperidae e são caracterizadas por sua atividade neurotóxica, ocasionando o bloqueio da junção neuromuscular. Apesar de o alvo dessas toxinas ser a junção neuromuscular, vários estudos utilizaram células neuronais centrais para caracterizar seus mecanismos de ação e estas se mostraram um bom modelo. Pouco se conhece, no entanto, sobre as atividades desempenhadas por essas enzimas em células da glia, como os astrócitos, sendo que este tipo celular desempenha funções importantes tanto no sistema nervoso central quanto periférico. O objetivo deste estudo foi caracterizar as ações da toxina FLA2 β-micrustoxina, isolada do veneno da serpente Micrurus lemniscatus, em astrócitos em cultura, quanto à viabilidade celular, proliferação celular, distribuição das fases do ciclo celular, expressão de proteínas regulatórias p53, p27 e p21, senescência celular e potencial da membrana mitocondrial. Ainda, avaliou-se a expressão proteica e gênica do receptor para FLA2 (FLA2R) e a ocorrência do processo de internalização da toxina em astrócitos e neurônios hipocampais em cultura. A sequência primária parcial da toxina foi identificada pela obtenção de fragmentos peptídicos por digestão proteolítica e comparação com base de dados. Astrócitos e neurônios hipocampais de ratos Wistar (CEUAIB – Protocolo n°1223/14) foram mantidos em cultura em meio DMEM + 10% SFB e meio Neurobasal + B27, respectivamente, a 37°C, 5% CO2. Os astrócitos foram tratados com a β–micrustoxina por diferentes períodos de tempo. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT e a proliferação celular, as fases do ciclo celular e as proteínas p53, p21 e p27 foram avaliadas por citometria de fluxo. A senescência celular foi avaliada pelo ensaio de β- galactosidase e o potencial da membrana mitocondrial foram avaliados utilizando a sonda TMRE. Para a análise da internalização celular, a β-micrustoxina foi conjugada ao fluoróforo Alexa 488 e observado o processo de internalização em microscópio confocal, em condições normais ou com a inibição da atividade FLA2. A β-micrustoxina reduziu a viabilidade e a proliferação celular de astrócitos e houve um predomínio da fase G2/M. Não houve fragmentação do DNA nem alteração do potencial mitocondrial. A β-micrustoxina induziu o aumento das proteínas regulatórias do ciclo celular p53, p21 e p27. Observou-se a internalização da β-micrustoxina tanto em astrócitos como em neurônios. Esse processo é dependente da atividade FLA2 em neurônios, mas não em astrócitos. O FLA2R está expresso em astrócitos com muita intensidade, mas também em neurônios hipocampais. Os dados obtidos permitem concluir que a β-micrustoxina interfere na proliferação celular de astrócitos, induzindo a parada do ciclo celular na fase G2/M, mediada pelas proteínas p53, p21 e p27, sem evidências de indução de morte celular. Além disso, os dados evidenciam que a β-micrustoxina pode induzir os seus efeitos através de sua internalização na célula. Este estudo contribui para o melhor entendimento dos eventos celulares que levam à toxicidade induzida pela FLA2 β-micrustoxina isolada do veneno da serpente Micrurus leminiscatus e abre perspectivas de desenvolvimento de novos fármacos com ações inibitórias sobre a proliferação celular.

Efeitos da obesidade induzida por dieta hipercalórica e de seu tratamento com exenatida sobre a neurotransmissão colinérgica muscarínica em hipocampo de ratos / Effects of obesity induced by hypercaloric diet and its treatment with exenatide on the muscarinic cholinergic neurotransmitter in rat hippocampus

Introduction: Molecular cloning studies have revealed the existence of five distinct muscarinic acethylcholine receptor (mAChRs) subtypes (M1 to M5), which interact, via a G protein-regulated process, with multiple effector systems. The M1, M3 and M5 subtypes couple primarily to PLC-mediated phosphoinositide hydrolysis, while the M2 and M4 subtypes couple primarily to adenylyl cyclase inhibition. In the Hippocampus, the modulation of excitatory transmission by mAChRs seems particularly relevant to learning and memory processing in the hippocampal formation, where the diversity and differential localization of the receptors are likely to account for the complex cholinergic modulation in this structure. Experimental studies has been shown that obesity-associated with hypercaloric diet impair learning and memory in rodents, suggesting a strong association between obesity and cognitive dysfunction. However, the mechanisms of how the obesity induced by hypercaloric diet affect memory are not understood fully. Objective: The aim of this study was to investigate the possible effects of obesity induced by hypercaloric diet and its treatment with exenatide, an antidiabetogenic and potential antiobesogenic drug derived from the venom of the Gila monster Heloderma suspectum, on the affinity, density, subtypes and intracellular signaling pathways linked to activation of mAChRs in rat hippocampus. Methodology: Male Wistar rats were divided into three groups: control (CT), obese induced by hypercaloric diet (DIO) and DIO treated with exenatide (DIO+E). The experimental procedures were approved by the Research Ethics Committee of the Butantan Institute (# 22381003/17). In the hippocampus obtained from CT, DIO and DIO+E were performed: I- [ 3H]QNB binding to determine the affinity (KD) and density (Bmax) of mAChRs; II- Expression of each mAChR subtype (M1 to M5) by immunoprecipitation assays and III- Determination of [3H]inositol phosphates accumulation. Results: Specific binding analysis showed that the affinity did not differ among CT, DIO and DIO+E. In contrast, the density of mAChRs obtained in DIO animals was lower than that obtained from CT rats. Moreover, the density of mAChRs from DIO+E was similar when compared with CT rats. Immunoprecipitation assays induced a decrease in the expression of M1 and M3 subtypes of DIO animals when compared with CT. Treatment with exenatide (DIO+E) recovered the expression of the two subtypes similar to CT. On the other hand, the M2, M4 and M5 subtypes did not differ among CT, DIO and DIO+E. Carbacol caused a concentration-dependent increase in the accumulation of [3 H]inositol phosphates in the 3 experimental groups. However, the magnitude of the maximal response to carbachol was lower in the DIO group compared to CT and DIO+E animals, which did not differ from each other. Conclusion: Our results indicate that obesity induced by hypercaloric diet strongly influences the expression and intracellular signaling coupled to M1-M3 subtypes. The exenatide reversed these effects, suggesting an important role on hippocampal muscarinic cholinergic system. This action of obesity might be a key step mediating cellular events important for learning and memory.

Introdução: Estudos de clonagem molecular revelaram a existência de cinco diferentes subtipos de receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChRs) (M1-M5) que interagem com múltiplos sistemas efetores através de um processo regulado pela proteína G. Os subtipos M1, M3 e M5 acoplam-se principalmente à hidrólise do fosfoinositídeos mediada pela fosfolipase C. Por outro lado, os subtipos M2 e M4 acoplam-se principalmente à inibição da adenililciclase. No hipocampo, a modulação da transmissão excitatória pelos mAChRs é relevante para o aprendizado e o processamento da memória aonde a diversidade e a localização diferencial dos mAChRs são responsáveis pela complexa modulação colinérgica nessa estrutura. Estudos experimentais demonstraram que a obesidade induzida por dieta hipercalórica prejudica o aprendizado e a memória em roedores, sugerindo uma associação entre obesidade e disfunção cognitiva. No entanto, os mecanismos pelos quais a obesidade afeta os processos cognitivos não são totalmente compreendidos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi investigar os possíveis efeitos da obesidade induzida por dieta hipercalórica e seu tratamento com exenatida, uma droga anti- diabetogênica e anti-obesogênica, derivada do veneno do Monstro-de-Gila (Heloderma suspectum), sobre a afinidade, densidade, subtipos e sinalização intracelular acoplada à ativação de mAChRs no hipocampo de ratos. Metodologia: Ratos machos Wistar foram divididos em três grupos: controle (CT), obeso induzido por dieta hipercalórica (DIO) e DIO tratado com exenatida (DIO+E). Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Butantan (no 22381003/17). No hipocampo obtido de animais CT, DIO e DIO+E foram realizados: I- Ensaios de saturação da ligação do [3H]QNB para determinar os parâmetros farmacológicos KD (afinidade) e Bmax (densidade); II- A expressão de cada subtipo de receptor muscarínico (M1 a M5) por ensaios de imunoprecipitação com anticorpo que reconhece cada um dos subtipos de mAChRs e III- Determinação do conteúdo intracelular de [3H]fosfatos de inositol. Resultados: A análise da ligação específica mostrou que a afinidade não diferiu entre os grupos CT, DIO e DIO-E. Contrariamente, a densidade de mAChRs obtida nos animais DIO foi menor que a observada em ratos CT. A densidade dos animais DIO+E foi similar ao CT. Animais DIO induziram uma diminuição na expressão dos subtipos M1 e M3 quando comparada com o CT. O tratamento com exenatida (DIO+E) recuperou a expressão dos dois subtipos similar ao CT. Por outro lado, os subtipos M2, M4 e M5 não diferiram entre os grupos CT, DIO e DIO+E. O carbacol causou um aumento, dependente da concentração, sobre o acumulo de [3H]fosfatos de inositol nos 3 grupos experimentais. Entretanto, a magnitude da resposta máxima ao carbacol foi menor no grupo DIO comparativamente aos animais CT e DIO+E que não diferiram entre si. Conclusão: Nossos resultados indicam que a obesidade induzida por dieta hipercalórica, influência de maneira contundente, por meio da diminuição da expressão e sinalização intracelular acoplada aos subtipos M1 e M3. A exenatida reverteu esses efeitos, sugerindo ter um papel importante na neurotransmissão colinérgica muscarínica hipocampal. O presente estudo é também o primeiro passo para outras abordagens como a avaliação da importância funcional dessa modulação sobre os mAChRs no hipocampo.

Variações proteômicas do efeito da peçonha de Bothrops jararaca em linhagens celulares tumorais de mama. / Proteomic variations of the effect of Bothrops jararaca snake venom on breast tumor cells

Cancer is characterized by unnatural cell growth that can result from genetic mutations escaping the apoptosis process. Cancer cells invade adjacent or distant tissues and, added to the process of angiogenesis and metastasis, they clump together to form the tumor. There are currently some papers describing the antitumorigenic biochemical characteristics of snake venom that claim that this type of venom is capable of inhibiting cell proliferation and promoting cell death by different means. However, there is no work characterizing the proteomic molecular effect of the tumor cell lines treatment with snake venom. In this work, we characterized the comparative, functional and quantitative differential proteome of the MCF-7 and MDA-MB231 tumor cell lines treated with Bothrops jararaca venom at different concentrations. Based on data obtained from the cytotoxic assays of B. jararaca venom treatment in these cells we subjected these lineages to low (0.63 μg / mL) and high / subcitotoxicity (2.5 μg / mL) doses of venom for 24 h. The cells were subjected to ice-cold 8M urea cell lysis, reduction and alkylation, trypsin digestion and desalination for analysis by high resolution liquid chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-MS / MS). In order to identify, quantify, characterize and compare the functional and biochemical proteins profile in which abundance changed significantly after venom treatment, we used MaxQuant, Perseus and PantherDB, Reactome and String software for data analysis. These analyzes show the differential expression of various proteins, such as histone H3, SNX3, HEL-S-156an, MCC2 and GSTM3. Several of these proteins play important cancer-related roles, such as cell proliferation, invasion, metastasis, apoptosis and stress response. Therefore, these data show that the venom or some of its components have a potential use for cancer therapy and may induce a homeostatic imbalance in cancer cells.

O câncer é caracterizado pelo crescimento não natural de células que podem resultar de mutações genéticas escapando do processo de apoptose. Células cancerosas invadem tecidos adjacentes ou distantes e, somado ao processo de angiogênese e metástase, elas se aglomeram umas sobre as outras formando o tumor. Atualmente, existem alguns trabalhos descrevendo as características bioquímicas anti-tumorigênicas de peçonha de serpentes que afirmam que este tipo de peçonha é capaz de inibir a proliferação celular e promover a morte celular por diferentes meios. Porém, não existe nenhum trabalho caracterizando o efeito molecular proteômico do tratamento de linhagens celulares tumorais com peçonha de serpentes. Neste trabalho, caracterizamos o proteoma diferencial comparativo, funcional e quantitativo das linhagens celulares tumorais MCF-7 e MDA-MB231, tratadas com peçonha de Bothrops jararaca em diferentes concentrações. Baseado nos dados obtidos dos ensaios citotóxicos do tratamento com a peçonha de B. jararaca nestas células, submetemos essas linhagens a doses baixas (0,63 μg/mL) e altas / sub-citotóxica (2,5 μg/mL) da peçonha por 24 h. As células foram submetidas à lise celular com ureia 8M gelada, redução e alquilação, digestão com tripsina e dessalinização para análise por nano-cromatografia líquida de alta resolução acoplada à espectrometria de massas (nLC-MS/MS). De modo a identificar, quantificar, caracterizar e comparar o perfil funcional e bioquímico das proteínas em que a abundância mudou significativamente após o tratamento com a peçonha, foram utilizados os softwares MaxQuant, Perseus e as ferramentas PantherDB, Reactome e String para análise dos dados. Essas análises mostram a expressão diferencial de diversas proteínas, tais como a histona H3, SNX3, HEL-S-156an, MCC2 e GSTM3. Várias dessas proteínas desempenham papéis importantes relacionados ao câncer, como proliferação celular, invasão, metástase, apoptose e resposta ao estresse. Portanto, esses dados mostram que a peçonha ou alguns de seus componentes possuem um potencial de uso para a terapia do câncer, podendo induzir um desequilíbrio homeostático nas células cancerosas.

Prospecção de moléculas com atividade antioxidante em ouriços-do-mar / Prospecting of molecules with antioxidant activity in sea urchins

Antioxidant molecules cause a decrease in oxidation, inhibiting the formation of free radicals. Known as reactive oxygen species (ROS), free radicals are molecules with one or more unpaired, unstable, highly reactive electrons capable of oxidizing neighboring molecules to gain electrons, damaging adjacent cells. Oxidative processes and ROS formation occur physiologically and, also in several pathologies, therefore, antioxidants are extremely relevant for disease prevention. Some chronic and neurodegenerative diseases have already been reversed in animal studies with the use of antioxidants such as cancer, cardiovascular disease (including atherosclerosis), autoimmune diseases, diabetes, Parkinson's disease, inflammation (including arthritis), and aging. Pigments found in sea urchins have already been associated with antioxidant activity. Therefore, the objective of this work is to search for new molecules with antioxidant activity in four species of sea urchin. The spines, carapace and coelomic fluid of the tropical species Echinornetra lucunter, Lytechinus variegatus, Arbacia lixula and the species Antarctica Sterechinus neumayeri were used in the study. Individually, the materials were fractionated into solid phase extraction (in C18 cartridges) eluting with 25, 50, 75 and 100°/o methanol v I v. The fractions submitted to RP-HPLC, in column C18 aiming at obtaining more pure molecules. The peaks obtained by chromatography were tested in in vitro antioxidant activity assays and tested too in MALDl-ToF. The species Echinometra lucunter and the Antarctica Sterechinus neumayeri presented promising results, which are demonstrated in this work.

Moléculas antioxidantes causam diminuição da oxidação, inibindo a formação de radicais livres. Conhecidos como espécies reativas de oxigênio (ROS), os radicais livres são moléculas com um ou mais elétrons não pareados, instáveis e altamente reativos, capazes de oxidar moléculas vizinhas para ganhar elétrons, danificando células adjacentes. Processos oxidativos e formação de ROS ocorrem fisiologicamente e, também em diversas patologias, portanto, os antioxidantes são extremamente relevantes para a prevenção de doenças. Algumas doenças crônicas e neurodegenerativas já foram revertidas, em estudos em animais, com o uso de antioxidantes, como câncer, doenças cardiovasculares (incluindo aterosclerose), autoimunes, diabetes, doença de Parkinson, inflamações (incluindo artrite) e envelhecimento. Pigmentos encontrados em ouriços-do-mar já foram associados à atividade antioxidante. Sendo assim, o objetivo deste trabalho é buscar novas moléculas com atividade antioxidante em quatro espécies de ouriço-do-mar. Os espinhos, carapaças e líquido celomático das espécies tropicais Echinometra lucunter, Lytechinus variegatus, Arbacia lixula e da espécie Antártica Sterechinus neumayeri foram utilizadas no estudo. Individualmente, os materiais foram fracionados em extração em fase sólida (em cartuchos C18) com eluição por 25, 50, 75 e 100% de metanol v/v. As frações submetidas a RP-HPLC, em coluna C18 visando obtenção de moléculas mais puras. Os picos obtidos pela cromatografia foram testados em ensaios in vitro de atividade antioxidante e também pelo MALDlToF. As espécies Echinometra /ucunter e a antártica Sterechinus neumayeri, apresentaram resultados promissores, os quais são demonstrados nesse trabalho.

Interação tumor-estroma durante a transição epitéliomesenquimal in vitro: envolvimento da integrina a11b1 e modulação da Crotoxina sobre este processo / Tumor-stroma interaction during in vitro epithelialmesenchymal transition: involvement of integrin a11 B1 and modulatory effect of Crotoxin on this process

During tumor progression, tumor cells are regulated by the microenvironment and acquire highly proliferative behavior within the epithelial compartment, having as characteristic the high motility and invasiveness to the adjacent stroma! tissue. This behavior is a result of the phenotypic alteration of epithelial tumor cells, due to a biological process called epithelial-rnesenchymal transition (EMT). ln this process, fibroblasts are pointed out as fundamental elements in the EMT induction, performing their functions via integrins. Recently, a11 has been shown to be a type I collagen receptor of mesenchyme-derived cells, particularly fibroblasts, which promote cell adhesion and migration to this substrate and may also contribute to the invasion of tumor cells, making it thus, an important target of study. Components obtained from snake venoms modulate integrin-mediated functions, resulting in modulation of cell signaling and consequently regulation of events involved with tumor progressions, such as proliferation, migration, and apoptosis. The aim of this study was 1) to evaluate in vitro the role of a11 integrin on EMT and its importance in the phenotype stabilization; 2) to evaluate the possible inhibitory effect of CTX on the function of this integrin in fibroblasts in spheroid model and; 3) to evaluate the modulatory effect of CTX on key markers in EMT in spheroid model. Firstly, epithelial cell lines (NMuMG and A549) treated with EMT-inducing factors were used to evaluate the expression of epithelial and mesenchymal markers. Secondly, the experimental model used was in vitro interaction between cancer-associated fibroblasts (CAFs-mock or CAF-a11) or normal fibroblasts (MRC-5) and tumor cell lines (A549 or Calu-3), evaluating: a) tumor cells proliferation inside the spheroids; b) invasion and migratory behavior of composite spheroids in type I collagen gel; c) secretion of TGF-ß1 by CAFs; d) expression of EMT markers: E-cadherin, N-cadherin, vimentin and a-SMA, by immunofluorescence assay and Western blotting; e) quantification of MMPs (9 and 13) by ELISA. Taken together, the data obtained allow us to assert that a11 integrin is modulated by growth factors involved with EMT and that its participation was fundamental for the stabilization of the myofibroblastic phenotype. CTX interfered with CAFs adhesion, tumor cells proliferation and its inhibitory effect during migration and cell invasion is more significant when the tumor-stroma interaction occurs in the spheroid model, accompanied by inhibition of the secretion of active TGF-ß1. Furthermore, CTX inhibited differentiation of MRC-5 cells in the tumor microenvironment and inhibited the expression of N-cadherin, a-SMA and av mesenchymal markers, evaluated in 2D or 3D matrices, by Western blot and confocal microscopy. This study shows CTX as an important modulatory molecule of the EMT process and highlights the mechanisms involved in the antitumor action described for CTX in experimental studies and clinical trials.

Durante a progressão tumoral, as células tumorais são reguladas pelo microambiente e adquirem comportamento altamente proliferativo dentro do compartimento epitelial, tendo como característica a alta motilidade e invasividade ao tecido estremai adjacente. Este comportamento é resultado da alteração fenotípica das células turnarais epiteliais, decorrente de um processo biológico denominado transição epitélio-mesenquimal (EMT). Neste processo, os fibroblastes são apontados como elementos fundamentais na indução da EMT, desempenhando suas funções via integrinas. Muito recentemente, foi demonstrado que a a11 é um receptor para colágeno tipo I de células derivadas do mesênquima, particularmente de fibroblastes, que promovem a adesão e migração celular a este substrato podendo, ainda, contribuir para a invasão das células turnarais, tornando-a assim, um importante alvo de estudo. Componentes obtidos de venenos de serpentes modulam funções mediadas por integrinas, resultando na modulação da sinalização celular e consequentemente, sobre a regulação de eventos envolvidos com a· progressão tumoral, tais como a proliferação, migração e apoptose. Portanto, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar in vitro a participação da integri na a11 sobre a EMT e sua importância na estabilização do fenótipo; 2) avaliar o possível efeito inibitório da CTX sobre a função desta integrina em fibroblastes no modelo de esferóide e; 3) avaliar o efeito modulatório da CTX sobre os marcadores-chave na EMT, em modelo de esferóide. Para tanto, primeiramente, foi utilizado linhagens de células epiteliais (NMuMG e A549) tratadas com fatores indutores da EMT para avaliação da expressão dos marcadores epiteliais e mesenquimais. Para o segundo delineamento experimental, foi empregado a interação in vitro entre as linhagens de fibroblastos associados ao câncer (CAFs-mock ou CAF-a11) ou fibroblastos normais (MRC-5) e as linhagens de célula tumoral (A549 ou Calu-3) no modelo de esferóide, avaliando-se: a) a proliferação de células turnarais dentro dos esferóides; b) a invasão e o comportamento migratório dos esferóides compostos no gel de colágeno tipo I; c) a secreção de TGF-ß1 pelas CAFs; d) a expressão das moléculas-chave da EMT: E-caderina, N-caderina, vimentina e a-SMA, por meio do ensaio de imunofluorescência e de Western blotting; e) quantificação de MMPs (9 e 13) por ELISA. Em conjunto, os dados obtidos nos permite afirmar que a integrina a11 é modulada por fatores de crescimentos envolvidos com a EMT e que sua participação foi fundamental para estabilização do fenótipo miofibroblástico. CTX interferiu com a adesão de CAFs e proliferação das células tumorais. O efeito inibitório da CTX durante a migração e invasão celular foi mais significativo quando ocorreu a interação tumor-estroma no modelo de esferóide, acompanhado da inibição da secreção de TGF-ß1 ativo. Ainda, a CTX inibiu a diferenciação de células MRC-5 no microambiente tumoral e inibiu a expressão dos marcadores mesenquimais Ncaderina, a-SMA e av, avaliados em matrizes 20 ou 30, por Western blot e microscopia confocal. Este estudo mostra a CTX como importante molécula moduladora do processo EMT e evidencia os mecanismos envolvidos na ação antitumoral descrita para a CTX em estudos experimentais e ensaios clínicos.

Prospecção de moléculas com atividade antioxidante em ouriços-do-mar / Prospecting of molecules with antioxidant activity in sea urchins

Antioxidant molecules cause a decrease in oxidation, inhibiting the formation of free radicals. Known as reactive oxygen species (ROS), free radicals are molecules with one or more unpaired, unstable, highly reactive electrons capable of oxidizing neighboring molecules to gain electrons, damaging adjacent cells. Oxidative processes and ROS formation occur physiologically and, also in several pathologies, therefore, antioxidants are extremely relevant for disease prevention. Some chronic and neurodegenerative diseases have already been reversed in animal studies with the use of antioxidants such as cancer, cardiovascular disease (including atherosclerosis), autoimmune diseases, diabetes, Parkinson's disease, inflammation (including arthritis), and aging. Pigments found in sea urchins have already been associated with antioxidant activity. Therefore, the objective of this work is to search for new molecules with antioxidant activity in four species of sea urchin. The spines, carapace and coelomic fluid of the tropical species Echinornetra lucunter, Lytechinus variegatus, Arbacia lixula and the species Antarctica Sterechinus neumayeri were used in the study. Individually, the materials were fractionated into solid phase extraction (in C18 cartridges) eluting with 25, 50, 75 and 100°/o methanol v I v. The fractions submitted to RP-HPLC, in column C18 aiming at obtaining more pure molecules. The peaks obtained by chromatography were tested in in vitro antioxidant activity assays and tested too in MALDl-ToF. The species Echinometra lucunter and the Antarctica Sterechinus neumayeri presented promising results, which are demonstrated in this work.

Moléculas antioxidantes causam diminuição da oxidação, inibindo a formação de radicais livres. Conhecidos como espécies reativas de oxigênio (ROS), os radicais livres são moléculas com um ou mais elétrons não pareados, instáveis e altamente reativos, capazes de oxidar moléculas vizinhas para ganhar elétrons, danificando células adjacentes. Processos oxidativos e formação de ROS ocorrem fisiologicamente e, também em diversas patologias, portanto, os antioxidantes são extremamente relevantes para a prevenção de doenças. Algumas doenças crônicas e neurodegenerativas já foram revertidas, em estudos em animais, com o uso de antioxidantes, como câncer, doenças cardiovasculares (incluindo aterosclerose), autoimunes, diabetes, doença de Parkinson, inflamações (incluindo artrite) e envelhecimento. Pigmentos encontrados em ouriços-do-mar já foram associados à atividade antioxidante. Sendo assim, o objetivo deste trabalho é buscar novas moléculas com atividade antioxidante em quatro espécies de ouriço-do-mar. Os espinhos, carapaças e líquido celomático das espécies tropicais Echinometra lucunter, Lytechinus variegatus, Arbacia lixula e da espécie Antártica Sterechinus neumayeri foram utilizadas no estudo. Individualmente, os materiais foram fracionados em extração em fase sólida (em cartuchos C18) com eluição por 25, 50, 75 e 100% de metanol v/v. As frações submetidas a RP-HPLC, em coluna C18 visando obtenção de moléculas mais puras. Os picos obtidos pela cromatografia foram testados em ensaios in vitro de atividade antioxidante e também pelo MALDlToF. As espécies Echinometra /ucunter e a antártica Sterechinus neumayeri, apresentaram resultados promissores, os quais são demonstrados nesse trabalho.

Effects of obesity induced by high-calorie diet and its treatment with exenatide on muscarinic acetylcholine receptors in rat hippocampus

Here, we described the effects of obesity induced by high-calorie diet and its treatment with exenatide, an anti-diabetogenic and potential anti-obesogenic drug derived from the venom of the Gila monster Heloderma suspectum, on the affinity, density, subtypes and intracellular signaling pathways linked to activation of muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) in rat hippocampus. Male Wistar rats were divided into three groups: control (CT), obese induced by high-calorie diet (DIO) and DIO treated with exenatide (DIO+E). [3H]Quinuclidinyl benzilate specific binding analysis showed that the equilibrium dissociation constant (KD) did not differ among CT, DIO and DIO+E, indicating that affinity is not affected by high-calorie diet or its treatment with exenatide. On the other hand, the density of mAChRs obtained in DIO animals was lower than that obtained from CT rats, and that DIO+E restored the density of mAChRs. Immunoprecipitation assays reveal a decrease in the expression of M1 and M3 subtypes of DIO animals when compared with CT. Treatment with exenatide (DIO+E) restored the expression of the two subtypes similar to obtained from CT. On the other hand, the M2, M4 and M5 mAChR subtypes expression did not differ among CT, DIO and DIO+E. Carbacol caused a concentration-dependent increase in the accumulation of total [3H] inositol phosphate in CT, DIO and DIO+E. However, the magnitude of the maximal response to carbachol was lower in DIO when compared with those obtained from CT and DIO+E animals, which did not differ from each other. Our results indicate that obesity induced by high-calorie diet strongly influences the expression and intracellular signaling coupled to M1-M3 mAChR subtypes. The exenatide ameliorated these effects, suggesting an important role on hippocampal muscarinic cholinergic system. This action of obesity induced by high-calorie diet and its treatment with exenatide might be a key step mediating cellular events important for learning and memory.Here, we described the effects of obesity induced by high-calorie diet and its treatment with exenatide, an anti-diabetogenic and potential anti-obesogenic drug derived from the venom of the Gila monster Heloderma suspectum, on the affinity, density, subtypes and intracellular signaling pathways linked to activation of muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) in rat hippocampus. Male Wistar rats were divided into three groups: control (CT), obese induced by high-calorie diet (DIO) and DIO treated with exenatide (DIO+E). [3H]Quinuclidinyl benzilate specific binding analysis showed that the equilibrium dissociation constant (KD) did not differ among CT, DIO and DIO+E, indicating that affinity is not affected by high-calorie diet or its treatment with exenatide. On the other hand, the density of mAChRs obtained in DIO animals was lower than that obtained from CT rats, and that DIO+E restored the density of mAChRs. Immunoprecipitation assays reveal a decrease in the expression of M1 and M3 subtypes of DIO animals when compared with CT. Treatment with exenatide (DIO+E) restored the expression of the two subtypes similar to obtained from CT. On the other hand, the M2, M4 and M5 mAChR subtypes expression did not differ among CT, DIO and DIO+E. Carbacol caused a concentration-dependent increase in the accumulation of total [3H] inositol phosphate in CT, DIO and DIO+E. However, the magnitude of the maximal response to carbachol was lower in DIO when compared with those obtained from CT and DIO+E animals, which did not differ from each other. Our results indicate that obesity induced by high-calorie diet strongly influences the expression and intracellular signaling coupled to M1-M3 mAChR subtypes. The exenatide ameliorated these effects, suggesting an important role on hippocampal muscarinic cholinergic system. This action of obesity induced by high-calorie diet and its treatment with exenatide might be a key step mediating cellular events important for learning and memory.

Crotoxin conjugated to SBA-15 nanostructured mesoporous silica induces long-last analgesic effect in the neuropathic pain model in mice

Neuropathic pain is a disease caused by structural and functional plasticity in central and peripheral sensory pathways that produce alterations in nociceptive processing. Currently, pharmacological treatment for this condition remains a challenge. Crotoxin (CTX), the main neurotoxin of Crotalus durissus terrificus rattlesnake venom, has well described prolonged anti-inflammatory and antinociceptive activities. In spite of its potential benefits, the toxicity of CTX remains a limiting factor for its use. SBA-15 is an inert nanostructured mesoporous silica that, when used as a vehicle, may reduce toxicity and potentiate the activity of different compounds. Based on this, we propose to conjugate crotoxin with SBA-15 (CTX:SBA-15) in order to investigate if when adsorbed to silica, CTX would have its toxicity reduced and its analgesic effect enhanced in neuropathic pain induced by the partial sciatic nerve ligation (PSNL) model. SBA-15 enabled an increase of 35% of CTX dosage. Treatment with CTX:SBA-15 induced a long-lasting reduction of mechanical hypernociception, without modifying the previously known pathways involved in antinociception. Moreover, CTX:SBA-15 reduced IL-6 and increased IL-10 levels in the spinal cord. Surprisingly, the antinociceptive effect of CTX:SBA-15 was also observed after oral administration. These data indicate the potential use of the CTX:SBA-15 complex for neuropathic pain control and corroborates the protective potential of SBA-15

Ethno-knowledge and attitudes regarding snakebites in the Alto Juruá region, Western Brazilian Amazonia

Background The Alto Juruá region, located in the extreme western part of the Brazilian Amazonia, possesses an indigenous and riverine population which is involved in agricultural and forest extraction activities, and is a region that stands out for its high incidence of snakebites. Objectives To assess the attitudes of the victims, the characteristics of the snakes and the circumstances of the snakebites which occurred in a region where human populations are highly exposed to snakes. Methods The study was conducted at the Regional Hospital of Juruá in the Municipality of Cruzeiro do Sul (Acre), which regularly attends victims of snakebites in the Alto Juruá region. The snakes that caused the envenomations were identified from clinical and epidemiological diagnosis of the symptoms and signs that patients presented during hospital, and by enzyme immunoassay for venom detection using serum samples of the patients, or by identification of the snake responsible for the envenomation when it was taken to the hospital or photographed. People who suffered or witnessed the snakebite were interviewed to assess the circumstances of the bite, the attitude adopted after the accident and whether they recognized the species of snake that caused the envenomation. Results There were 133 cases of snakebite (76.24/100.000 inhabitants), mainly involving male individuals living in the rural area and who had a low level of education. The most affected groups were farmers (48%) and children and teenagers (39%). It was observed that 8.3% of them presented a history of recurrence for bites. The lower limbs were the most affected anatomical region (84%). The Bothrops atrox snake, mainly small specimens (mostly juveniles), was the main species involved in the envenomations (83.4%). Snakebites occurred mainly in forest areas, backyards of houses in rural areas and near to aquatic environments, during activities (walking, farming, extractivism, hunting). Most of the time, the snake was on the ground and the bite occurred because of the approximation of the individual, either by trampling or by approximation of a hand. Half of the victims performed some kind of inadequate first aid (not drinking water, use of tourniquet, incision at the site of the bite, use of black stone, drinking a compound "Específico Pessoa"). Conclusions Snakebite is an important cause of morbidity in the Alto Juruá region. Bothrops bites are mostly caused by small-sized specimens, probably due to the greater abundance of B. atrox juveniles, and also because small snakes are more difficult for people to see. People are more often bitten on the lower limbs probably due to the size of B. atrox (small and medium) and because the snakes are usually on the ground in most situations. Many victims resort to ineffective actions that can cause complications and also delay serotherapy. A low level of education is a factor that may contribute to worse outcomes in snakebites since it is associated with a lack of knowledge of preventive and first aid measures.

Mitogen-activated protein kinase signaling mediates morphine induced-delayed hyperalgesia

The use of morphine, the standard opioid drug, is limited by its undesirable effects, such as tolerance, physical dependence, and hyperalgesia (increased pain sensitivity). Clinical and preclinical studies have reported development of hyperalgesia after prolonged opioid administration or after a single dose of intrathecal (i.t.) morphine in uninjured rats. However, whether a single standard systemic morphine dose is sufficient to decrease the nociceptive threshold in rats is unknown. Here, we showed that a single morphine subcutaneous injection induces analgesia followed by a long-lasting delayed hyperalgesia in uninjured and PGE2 sensitized rats. The i.t injection of extracellular signal-regulated kinase (ERK) inhibitor blocked morphine-induced analgesia, without interfering with the morphine-induced hyperalgesia. However, i.t. injection of SB20358, a p38 inhibitor and SP660125, a JNK inhibitor, decreased the morphine-induced hyperalgesia. Consistently with the behavioral data, Western Blot analysis showed that ERK is more phosphorylated 1 h after morphine, i.e., when the analgesia is detected. Moreover, phospho-p38 and phospho-JNK levels are upregulated 96 h after morphine injection, time that coincides with the hyperalgesic effect. Intrathecal (i.t.) oligodeoxynucleotide (ODN) antisense to cAMP-responsive element binding protein (CREB) attenuated morphine-induced hyperalgesia. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis showed that CREB downstream genes expressions were significantly up-regulated 96 h after morphine injection in spinal cord. Together, our data suggest that central ERK is involved in the analgesic and hyperalgesic effects of morphine while JNK, p38, and CREB are involved in the morphine-induced delayed hyperalgesia.