ABSTRACT
The biochemical pathways involved in nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) biosynthesis converge at the enzymatic step catalysed by nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT, EC: 2.7.7.1). The majority of NMNATs are assembled into homo-oligomeric states that comprise 2-6 subunits. Recently, the NMNAT of Plasmodium falciparum (PfNMNAT) has been identified as a pharmacological target. The enzymatic characterisation, cellular location, and tertiary structure of the PfNMNAT protein have been reported. Nonetheless, its quaternary structure remains to be explored. The present study describes the oligomeric assembly of the 6 x His-PfNMNAT recombinant protein using immobilised metal affinity chromatography coupled with size exclusion chromatography (SEC) and native protein electrophoresis combined with Ferguson plot graphing. These chromatographic approaches resulted in the elution of an active monomer from the SEC column, whereas the Ferguson plot indicated a dimeric assembly of the 6 x His-PfNMNAT protein.
Subject(s)
Humans , Plasmodium falciparum/enzymology , Plasmodium falciparum/chemistry , Chromatography, Affinity , Nicotinamide-Nucleotide Adenylyltransferase , Nicotinamide-Nucleotide Adenylyltransferase/therapeutic useABSTRACT
After invasion of red blood cells, malaria matures within the cell by degrading hemoglobin avidly. For enormous protein breakdown in trophozoite stage, many efficient and ordered proteolysis networks have been postulated and exploited. In this study, a potential interaction of a 60-kDa Plasmodium falciparum (Pf)-heat shock protein (Hsp60) and Pf-calpain, a cysteine protease, was explored. Pf-infected RBC was isolated and the endogenous Pf-Hsp60 and Pf-calpain were determined by western blot analysis and similar antigenicity of GroEL and Pf-Hsp60 was determined with anti-Pf-Hsp60. Potential interaction of Pf-calpain and Pf-Hsp60 was determined by immunoprecipitation and immunofluorescence assay. Mizoribine, a well-known inhibitor of Hsp60, attenuated both Pf-calpain enzyme activity as well as P. falciparum growth. The presented data suggest that the Pf-Hsp60 may function on Pf-calpain in a part of networks during malaria growth.
Subject(s)
Humans , Amino Acid Sequence , Calpain/genetics , Chaperonin 60/chemistry , Erythrocytes/parasitology , Malaria, Falciparum/parasitology , Molecular Sequence Data , Plasmodium falciparum/chemistry , Protein Binding , Protozoan Proteins/chemistry , Sequence AlignmentABSTRACT
Anopheles darlingi Root is the major vector of human malaria in the Neotropics and has been considered to be the sole malaria vector in French Guiana. The presence of other potential vectors suggests that malaria may be transmitted by other species under certain conditions. From 2006-2011, all anopheline specimens collected from 11 localities were assayed to determine if the Plasmodium circumsporozoite protein was present. In addition to An. darlingi, we found Anopheles oswaldoi, Anopheles intermedius and Anopheles nuneztovari specimens that were infected with Plasmodium sp. Further investigations on the behaviour and ecology of An. oswaldoi, An. intermedius and An. nuneztovari are necessary to determine their role in malaria transmission in French Guiana.
Subject(s)
Animals , Female , Humans , Anopheles/parasitology , Insect Vectors/parasitology , Plasmodium falciparum/chemistry , Plasmodium malariae/chemistry , Plasmodium vivax/chemistry , Protozoan Proteins/analysis , Anopheles/classification , Enzyme-Linked Immunosorbent Assay , French Guiana , Insect Vectors/classification , Malaria/transmission , Population Density , Plasmodium falciparum/isolation & purification , Plasmodium malariae/isolation & purification , Plasmodium vivax/isolation & purification , SeasonsABSTRACT
A 57-year old man who was admitted to an emergency room of a tertiary hospital with hemoptysis developed malarial fever 19 days later and then died from severe falciparum malaria 2 days later. He had not traveled outside of Korea for over 30 years. Through intensive interviews and epidemiological surveys, we found that a foreign patient with a recent history of travel to Africa was transferred to the same hospital with severe falciparum malaria. We confirmed through molecular genotyping of the MSP-1 gene that Plasmodium falciparum genotypes of the 2 patients were identical. It is suggested that a breach of standard infection control precautions resulted in this P. falciparum transmission between 2 patients in a hospital environment. This is the first report of a nosocomial transmission of falciparum malaria in Korea.
Subject(s)
Animals , Humans , Male , Middle Aged , Africa , Amino Acid Sequence , Cross Infection/parasitology , Fatal Outcome , Korea , Malaria, Falciparum/parasitology , Merozoite Surface Protein 1/chemistry , Molecular Sequence Data , Plasmodium falciparum/chemistry , Protozoan Proteins/chemistry , Sequence Alignment , TravelABSTRACT
Introducción: la búsqueda de nuevas drogas o alternativas terapéuticas para el tratamiento de la malaria es una alta prioridad en la lucha por el control de esta enfermedad. En la actualidad, varios estudios se concentran en la evaluación de inhibidores de proteasas de tipo aspártico presentes en la vacuola digestiva de Plasmodium falciparum, las cuales son parte de las enzimas que participan en la degradación de la hemoglobina. Los escasos reportes en la literatura sobre la purificación de inhibidores de proteasas aspárticas a partir de organismos marinos sugieren que constituyen una fuente de este tipo de moléculas prácticamente inexplorada. Métodos: las especies de invertebrados marinos Phallusia nigra, Bugula sp., Lyssodendoryx isodictyalis, Ascidia sydneiensis, Microscosmus goanus, Holothuria mexicana, Lytechinus variegatus y Echinaster sp. fueron colectadas en la localidad de Puerto Esperanza, Pinar del Río, en abril de 2006 y se prepararon extractos etanólicos. Se realizó la evaluación antimalárica in vitro contra Plasmodium falciparum de estos extractos con valores descriptivos de eficacia comparables a los utilizados internacionalmente. Los resultados se relacionaron con los hallazgos de los ensayos de inhibición de la actividad enzimática de pepsina como modelo de proteasa aspártica y con el perfil químico de metabolitos secundarios en estos extractos. Resultados: se encontró una buena reproducibilidad de la actividad antimalárica de los extractos de P. nigra, M. goanus y L. isodictyalis con concentraciones inhibitorias medias menores que 50 µg/mL. El extracto de M. goanus mostró la posible presencia de un inhibidor de pepsina. El perfil químico obtenido para las ascidias se corresponde con los principales compuestos reportados para las familias Pyuridae y Ascidiidae. La actividad antimalárica, así como la actividad inhibidora de pepsina, pudiera ser atribuida a algunos de los grupos de metabolitos secundarios detectados...
Background: the search for new drugs or therapeutic alternatives for malaria treatment is a high priority in the struggle against this disease. At present, several studies are focused on the evaluation of aspartic protease inhibitors present in the digestive vacuole of Plasmodium falciparum, which are part of the enzymes involved in hemoglobin degradation. The few reports in literature on the purification of aspartic proteases inhibitors from marine organisms suggest that they are a practically unexplored source of this type of molecules. Methods: marine invertebrate species Phallusia nigra, Bugula sp., Lyssodendoryx isodictyalis, Ascidia sydneiensis, Microscosmus goanus, Holothuria mexicana, Lytechinus variegatus y Echinaster sp.were detected in Puerto Esperanza area, Pinar del Rio province, on April 2006 and then ethanol extracts were prepared. In vitro antimalarial evaluation of these extracts against Plasmodium falciparum, with descriptive efficacy values being comparable with those used worldwide. The results were associated to the findings of aspartic protease model-like pepsin enzymatic action inhibition tests and to the chemical profile of secondary metabolites in these extracts. RESULTS: good reproducibility of antimalarial action of P. nigra, M. goanus y L. isodictyalis extracts was found, being the average inhibitory concentrations lower than 50 µg/mL. M. goanus extract showed a possible pepsin inhibitor. The chemical profile for ascidians corresponded to the main compounds reported in Pyuridae y Ascidiidae families. The antimalarial activity as well as the pepsin inhibitory activity might be attributed to some of the detected secondary metabolites. Conclusions: the breaking-up of these extracts is recommended in order to isolate the chemical compounds involved in the studied biological activities.
Subject(s)
Antimalarials/analysis , Malaria/drug therapy , Protease Inhibitors , Pepsin A/isolation & purification , Plasmodium falciparum/enzymology , Plasmodium falciparum/chemistryABSTRACT
The invasion of the erythrocyte by Plasmodium falciparum depends on the ability of the merozoite to move through the membrane invagination. This ability is probably mediated by actin dependent motors. Using affinity columns with G-actin and F-actin we isolated actin binding proteins from the parasite. By immunoblotting and immunoprecipitation with specific antibodies we identified the presence of tropomyosin, myosin, a-actinin, and two different actins in the eluate corresponding to F-actin binding proteins. In addition to these, a 240-260 kDa doublet, different in size from the erythrocyte spectrin, reacted with an antibody against human spectrin. All the above mentioned proteins were metabolically radiolabeled when the parasite was cultured with 35S-methionine. The presence of these proteins in P. falciparum is indicative of a complex cytoskeleton and supports the proposed role for an actin-myosin motor during invasion.
Subject(s)
Animals , Microfilament Proteins/isolation & purification , Plasmodium falciparum/chemistry , Actins/immunology , Actins/isolation & purification , Chromatography, Affinity/methods , Immunoblotting , Microfilament Proteins/immunology , Myosins/immunology , Myosins/isolation & purification , Precipitin TestsABSTRACT
The effects of the antibiotics, doxycycline, azithromycin, ciprofloxacin and chloramphenicol, upon levels of nucleoside-5'-triphosphates (NTPs) and 2'-deoxynucleoside-5'-triphosphates (dNTPs) have been compared in the malarial parasite, Plasmodium falciparum, and in human CCRF-CEM leukemia cells. All 4 antibiotics had more severe effects upon levels of NTPs and dNTPs in P. falciparum compared with leukemia cells providing an explanation for their selective toxicity against malaria and their utility as antimalarial drugs. In bacteria, the first 3 drugs inhibit protein synthesis while ciprofloxacin inhibits topoisomerase II. The observed depletions of NTPs and dNTPs would be a secondary effect of the drug but may result in death of the parasite.
Subject(s)
Animals , Anti-Bacterial Agents/pharmacology , Azithromycin/pharmacology , Chloramphenicol/pharmacology , Ciprofloxacin/pharmacology , Deoxyribonucleotides/analysis , Doxycycline/pharmacology , Nucleotides/analysis , Plasmodium falciparum/chemistryABSTRACT
Con el fin de obtener proteínas de unión a actina de extractos de P. falciparum marcados radioactivamente, se prepararon columnas de afinidad con actina-F (fibrilar), actina-G (globular) y albúmina sérica bovina. Se comprobó la polimerización y se cuantificó la unión de los ligandos a la resina activada. Los resultados obtenidos demostraron una alta especificidad de las columnas. Se obtuvieron cuatro proteínas que se unieron a la columna de actina-G y 16 que se unieron a la columna de actina F
Subject(s)
Animals , Plasmodium falciparum/chemistry , Microfilament Proteins/analysis , Chromatography, AffinityABSTRACT
En muchos casos, el estudio de la regulación de la expresión de genes específicos, requiere el aislamiento de su RNA mensajero (mRNA) a partir del RNA total presente en la célula. Con el fin de garantizar la prescencia de secuencias que se expresan en baja abundancia, es indispensable obtener preparaciones de mRNA que sean representativas de la población de mensajeros del organismo de en estudio. En este trabajo se evaluó el rendimiento del mRNA de Plasmodium faciparum obtenido por dos métodos: cromatografía de afinidad en columnas de oligo dT celulosa y captura del mRNA por hibridización en solución con un primer oligo dT. Con los dos métodos, se obtuvieron rendimientos similares en un rango entre 07, y 1,1 por ciento con respecto al RNA total de cromatografía fue de 0,4 a 4 Kb, mientras que los provenientes del método de captura, permitieron un rango entre 0,4 y 8 Kb. Este hecho sugiere las mejores posibilidades que ofrece el método de captura para obtener poblaciones de mensajeros con mayores tamaños, si se compara con el método tradicional. La presencia de clones con genes de copia única como son los de tubulina, actina II, miosina, calmodulina, glucosa fosfato-isomerasa y glucosa-fosfato-deshidrogenasa, en genotecas de cDNA, permiten inferir una buena representatividad de las secuencias expresadas en la preparación de mRNA
Subject(s)
Animals , Plasmodium falciparum/chemistry , RNA, Messenger/isolation & purification , Chromatography, Affinity , Hybridization, GeneticABSTRACT
En el presente trabajo se reporta el primer DNA satélite (PFCOL692) aislado para Plasmodium falciparum. La unidad básica es una secuencia de aproximadamente 700 pares de bases (pb). Las dos variantes secuenciadas presentan una homología del 85 por ciento. Los patrones de bandas producidos al hibridar digestiones de DNA del parásito con el DNA satélite marcado radioactivamente, permitieron detectar la existencia de muchas más variantes. Además, las variantes se encuentran a nivel subtelomérico organizadas en bloques de seres unidos cabeza a cola. Por la localización esta secuencia debe jugar un papel importante en los rearreglos que producen polimorfismo cromosómico y antigénico en Plasmodium falciparum. De los patrones de bandas obtenidos por la hibridación de esta secuencia con DNA de diferentes aislados digeridos con enzima de restricción, se pudo ver la utilidad de esta secuencia para caraterizar cepas en el laboratorio. Se construyó una genoteca de Plasmodium falciparum en el fago Lambda EMBL-4 y fueron aislados 28 clonos que contienen la secuencia PFCOL692. El resultado del manejo de restricción de los clonos (en otro trabajo) confirman la organzación planteada. Como otra parte del trabajo se construyó una genoteca de Plasmodium falciparum en el fago Lamda gt10. Se diseño una sonda de oligonucleótidos con base en la secuencia del gen de calmodulina de Plasmodium falciparum. Con la sonda, se aisló un clon que contiene la mayoría del gen de calmodulina del parásito
Subject(s)
DNA, Satellite/isolation & purification , Calmodulin/genetics , Academic Dissertations as Topic , Genomic Library , Plasmodium falciparum/chemistry , Plasmodium falciparum/genetics , Repetitive Sequences, Nucleic AcidABSTRACT
Cultivos de Plasmodium falciparum, cepa FCB1 parcialmente sincronizados con sorbitol al 5 por ciento, fueron sometidos a marcación metabólica con superíndice 35 S-metionina o con üH-isoleucina, durante todo el desarrollo intraeritrocítico. La liberación de proteínas solubles o exoproteinas marcadas con superíndice 35 S- metionina al medio de cultivo fué baja durante el desarrollo de anillos y trofozoitos maduros, aumentó durante la esquizogonia y fué máxima en el proceso de disrupción de las células rojas infectadas con esquizontes y en la reinvasión de los merozoítos. Las exoproteínas fueron obtenidas de células rojas infectadas con esquizontes, concentradas por un gradiente isopícnico de Percoll (96), en ausencia de suero, con el objeto de evitar la inteferencia de los componentes del suero, para su posterior análisis. Las exoproteínas liberadas por el parásito presentan patrones electroforéticos (SDS-PAGE) diferentes, si son obtenidas en presencia o en ausencia de eritrocitos. Se identificaron aproximadamente 35 polipétidos de Mr entre 200.000 y 19.000. Tres polipéptidos de Mr 77.000, 48.000 y 36.000 están presentes en el sobrenadante del cultivo cuando el merozoíto invade nuevos eritrocitos. Estas proteínas podrían estar asociadas a la cubierta celular del merozoíto, ya que se ha demostrado por microscopía electrónica que esta es dejada por el parásito cuando invade (20,21). Estas exoproteínas están ausentes en el medio de cultivo cuando el merozoíto no invade. Cuatro polipéptidos de Mr 153.000, 86.000, 65.800 y 65.000 fueron identificados solo cuando las exoproteínas fueron obtenidas en ausencia de eritrocitos (no ocurre invasión) y están ausentes en exoproteínas obtenidas en presencia de eritrocitos. Esto parece sugerir que se adhiere al eritrocito y se pierde en el proceso de invasión. Incubando exoproteínas obtenidas en ausencia de eritrocitos con eritrocitos no infectados a concentraciones de 0.5 x 10 superíndice 6 células rojas/ml se observó la desaparición de bandas del patrón electroforético (SDS-PAGE) de Mr 153.000, 139.000, 136.000, 86.000 y 65.000 con respecto al patrón en ausencia de eritrocitos, confirmando nuevamente aquellas proteínas que se pierden en el proceso de invasión. Aún no se ha demostrado la especificidad de la unión de estas proteínas por la membrana del eritrocito. Por medio de inmunoprecipitaciones de las exoproteínas con sueros de pacientes parcialmente...