Insulin-like growth factor 1 gene (CA)n repeats and a variable number of tandem repeats of the insulin gene in Brazilian children born small for gestational age

OBJECTIVE: To investigate the influence of (CA)n repeats in the insulin-like growth factor 1 gene and a variable number of tandem repeats of the insulin gene on birth size in children who are small or adequate-sized for gestational age and to correlate these polymorphisms with serum insulin-like growth factor 1 levels and insulin sensitivity in children who are small for gestational age, with and without catch-up growth. PATIENTS AND METHODS: We evaluated 439 infants: 297 that were adequate-sized for gestational age and 142 that were small for gestational age (66 with and 76 without catch-up). The number of (CA)n repeat in the insulin-like growth factor 1 gene and a variable number of tandem repeats in the insulin gene were analyzed using GENESCAN software and polymerase chain reaction followed by enzymatic digestion, respectively. Clinical and laboratory data were obtained from all patients. RESULTS: The height, body mass index, paternal height, target height and insulin-like growth factor 1 serum levels were higher in children who were small for gestational age with catch-up. There was no difference in the allelic and genotypic distributions of both polymorphisms between the adequate-sized and small infants or among small infants with and without catch-up. Similarly, the polymorphisms were not associated with clinical or laboratory variables. CONCLUSION: Polymorphisms of the (CA)n repeats of the insulin-like growth factor 1 gene and a variable number of tandem repeats of the insulin gene, separately or in combination, did not influence pre- or postnatal growth, insulin-like growth factor 1 serum levels or insulin resistance. .

Tall stature and poor breast development after estrogen replacement in a hypergonadotrophic hypogonadic patient with a 45,X/46,X,der(X) karyotype with SHOX gene overdosage / Estatura alta e hipodesenvolvimento mamário após reposição estrogênica em paciente com hipogonadismo hipergonadotrófico e cariótipo 45,X/46,X, der(X) com superdosagem do gene SHOX

SHOX is exclusively expressed in the developing distal limb bones of human embryos and in the first and second pharyngeal arches. It works as a promoter for linear growth and as a repressor of growth plate fusion. It was reported, recently, that SHOX overdosage and gonadal estrogen deficiency have led to tall stature due to continued growth. We report, in the present study, a female patient with 45,X/46,X, psu idic(X)(pter→q21::q21→pter) karyotype, tall stature, and hypergonadotrophic hypogonadism without Turner stigmas. She did not present breast development even after long term therapy with high estrogen doses. Fluorescence in situ hybridization depicted the presence of three copies of SHOX gene. Microsatellite studies showed paternal origin of der(X). Further studies in similarly affected patients will clarify if the absence of breast development, despite previous high-dose estrogen treatment, is associated to triple copy of SHOX gene.

O gene SHOX é expresso, exclusivamente, no primeiro e no segundo arcos faríngeos, assim como nas extremidades dos ossos dos membros em embriões humanos. SHOX normalmente atua como um promotor para o crescimento linear e como um repressor do fechamento da placa de crescimento. Recentemente, foi descrito que o excesso da proteína SHOX associada à deficiência estrogênica gonadal leva à estatura alta devido ao contínuo crescimento. Neste estudo descrevemos uma paciente do sexo feminino com cariótipo 45,X/46,X,psu idic(X)(pter→q21::q21→pter), estatura alta, hipogonadismo hipergonadotrófico e sem estigmas de Turner. A paciente não apresentou desenvolvimento de mamas, mesmo depois do tratamento prolongado com altas doses de estrógenos. FISH evidenciou a presença de três cópias do SHOX. Estudo de microssatélites demonstrou a origem paterna do der(X). Estudos futuros em pacientes com semelhanças clínicas esclarecerão se a ausência de desenvolvimento de mamas, apesar do tratamento com altas doses de estrógenos, está associada à tripla cópia do SHOX.

Utilidad del estudio molecular de CYP21A2 en el manejo prenatal de hiperplasia suprarrenal congénita: detección de dos nuevas mutaciones en Chile / Molecular study of CYP21A2 gene for prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia: Report of a family

Prenatal treatment of pregnancies at risk of congenital adrenal hyperplasia (CAH) may prevent ambiguous genitalia in female fetuses. We present the prenatal treatment performed in an extended family with two mutations. The proband, a boy with CAH-salt losing form, and his relatives were studied. The proband's paternal uncles/aunts were married to the maternal aunts/uncles, respectively. The relatives had normal basal and stimulated 170HProgesterone levels, which did not clarify their carrier status. The CYP21A2 gene was sequenced. The proband and the paternal relatives harbored a Q318X, R483W mutation in one alíele. The maternal relatives and the proband exhibited an R483 frameshift mutation. Early dexametasone treatment was given during two pregnancies and stopped when male gender was confirmed by early ultrasonography Both newborns were healthy and had normal 170HProgesterone levels. This family had three mutations which abolish the 21-hydroxilase activity. Two mutations were detected in codon 483 of CYP21A2 gene, exon 10, which have not been reported previously in Latin-America. The molecular study performed in this family allowed us to give an appropriate genetic counseling and prenatal treatment.

Frequency of the allelic variant (Trp8Arg/Ile15Thr) of the luteinizing hormone gene in a Brazilian cohort of healthy subjects and in patients with hypogonadotropic hypogonadism

OBJETIVO: Avaliar a freqüência da variante alélica (Trp8Arg/Ile15Thr) do gene da subunidade b do hormônio luteinizante em um grupo de brasileiros saudáveis e em pacientes portadores de hipogonadismo hipogonadotrófico.CASUÍSTICA E MÉTODOS: Duzentos e dois adultos (115 mulheres) com função sexual preservada e 48 pacientes (24 mulheres) portadoras de hipogonadismo hipogonadotrófico foram submetidos a estudo molecular utilizando técnicas de reação em cadeia da polimerase seguida por digestão enzimática com as enzimas de restrição Nco I (para detecção da mutação pontual Trp8Arg) e Fok I (para detecção da mutação pontual Ile15Thr). Os níveis basais de hormônio luteinizante e FSH, testosterona ou estradiol foram dosados em 37 indivíduos normais (21 mulheres) e 27 pacientes portadores de hipogonadismo hipogonadotrófico (13 mulheres) pelo método imunofluorométrico (hLH-Spec and hFSH-Spec, AutoDELFIA, Wallac Oy, Turku, Finland).RESULTADOS: A variante alélica (Arg8/Thr15) do gene da subunidade b do LH apresentou freqüência similar nos indivíduos saudáveis (14.4%) e nos pacientes portadores de hipogonadismo hipogonadotrófico (16.6%). Não houve interferência da variante alélica do gene da subunidade b do LH nos níveis de LH dos indivíduos normais e dos pacientes portadores de hipogonadismo hipogonadotrófico.CONCLUSÃO: Este estudo indica que a variante alélicaArg8/Thr15 do gene da subunidade b do LH é um polimorfismo comum na população brasileira (14.4%). A freqüência similar dessa variante em indivíduos saudáveis e em portadores de hipogonadismo hipogonadotrófico exclui o papel da variante na etiologia do hipogonadismo hipogonadotrófico.

Padronização da técnica de extração de DNA de células de mucosa oral com NaCl: aplicação no estudo do gene PROP1 / Standardization of DNA extraction with NaCl from oral mucosa cells: application in PROP1 gene study

A extração de DNA de leucócitos periféricos é o meio de obtenção de DNA mais amplamente utilizado. Entretanto, a coleta de células a partir de swab oral, geralmente utilizada em medicina forense, é útil para obtenção de amostras de DNA de recém-nascidos, crianças e de pacientes que vivem em locais onde a coleta e o envio da amostra de sangue não é factível. Nosso objetivo foi padronizar a técnica de extração de DNA a partir de swab de células de mucosa oral utilizando NaCl, comparando-a com a extração pelo kit comercial. Para testar a qualidade do DNA, amplificamos os 3 éxons do gene PROP1 de 12 pacientes com hipopituitarismo hipofisário em DNA extraído simultaneamente de células da mucosa oral e de sangue periférico. A amplificação de fragmentos maiores foi testada em DNA de mucosa oral de indivíduos normais utilizando-se primers do éxon 10 do gene do FSHR (1000pb) e do gene CYP21A2 (1200pb). Ambos os métodos resultaram em DNA de boa qualidade, permitindo o estudo molecular. O método por NaCl mostrou-se mais rápido e barato, resultando em maior quantidade de DNA quando comparado ao kit comercial. Nos pacientes com hipopituitarismo, identificamos a mutação delAG301-302 em 6 pacientes, 4 em homozigose (33 por cento) e 2 em heterozigose (16 por cento), e a mutação G51A em heterozigose em uma paciente. Em conclusão, padronizamos a técnica de extração de DNA de células de swab oral com NaCl que, quando comparada à extração com kit comercial, apresentou menor custo e maior rapidez, indicando ser esta uma forma confiável de obtenção de DNA para estudos genéticos.

Síndrome de insensibilidade aos andrógenos: análise clínica, hormonal e molecular de 33 casos / Androgen insensitivity syndrome: clinical, hormonal and molecular analysis of 33 cases

A síndrome de insensibilidade aos andrógenos (AIS) é uma doença com herança ligada ao cromossomo X que afeta pacientes com cariótipo 46,XY, nos quais há prejuízo total (forma completa, CAIS) ou parcial (PAIS) do processo de virilização intra-útero devido à alteração funcional do receptor de andrógenos (AR). Apresentamos uma revisão da AIS e do AR com os dados clínicos, hormonais e moleculares de 33 casos. Analisamos a região codificadora do gene do AR em 33 pacientes de 21 famílias, com quadro clínico e hormonal sugestivo de AIS. Onze pacientes (9 famílias) com diagnóstico de CAIS e 22 pacientes (12 famílias) com diagnóstico de PAIS. Identificamos mutações no gene do receptor androgênico e a etiologia da síndrome de insensibilidade aos andrógenos em 86 por cento das 21 famílias estudadas: 100 por cento das famílias com insensibilidade completa aos andrógenos e 75 por cento das famílias com insensibilidade parcial aos andrógenos. Identificamos 9 mutações no AR descritas anteriormente na literatura (N705S, W741C, M742V, R752X, Y763C, R779W, M807V, R855C e R855H) e 7 mutações foram descritas pela primeira vez nesta casuística (S119X, T602P, L768V, R840S, I898F, P904R e IVS3 - 60 G>A).

Founder effect for the highly prevalent R337H mutation of tumor suppressor p53 in Brazilian patients with adrenocortical tumors

A incidência dos tumores adrenocorticais em crianças das regiões sul e sudeste do Brasil é maior que em outras partes do mundo. Este fato tem sido atribuído a identificação com alta frequência (78-97%) da mutação R337H no p53 em crianças brasileiras com tumores adrenocorticais. Considerando a elevada freqüência desta mutação germinativa na população brasileira, é provável que a mutação R337H tenha uma origem comum. Neste estudo, analisamos 2 marcadores polimórficos intragênicos (VNTRp53 e p53CA) em 22 pacientes (16 crianças e 6 adultos) com tumores adrenocorticais portadores da mutação germinativa R337H e em 60 indivíduos normais, através do programa GeneScan de análise de fragmentos. Seis e 16 alelos dos marcadores polimórficos VNTRp53 e p53CA foram respectivamente identificados. Dois alelos, ambos com 122 bp, foram identificados em 56,8% (VNTRp53) e 54,5% (p53CA) dos 44 alelos dos pacientes com tumores adrenocorticais. Em contraste, estes mesmos marcadores foram encontrados respectivamente em 18,3% e 14,2% dos 120 alelos dos indivíduos normais (p< 0,01, teste do chi-quadrado). Identificamos também, um haplótipo idêntico para o locus p53 em 95% dos pacientes com tumores adrenocorticais com a mutação R337H. Em conclusão, demonstramos uma forte evidência de co-segregação entre dois marcadores polimórficos intragênicos do p53 e a mutação germinativa R337H, indicando que esta mutação teve origem num ancestral comum na maioria dos pacientes brasileiros com tumores adrenocorticais.

Estudo multicêntrico de pacientes brasileiros com deficiência da 21-hidroxilase: correlação do genótipo com o fenótipo / Multicentric study of Brazilian patients with 21-hydroxylase deficiency: a genotype-phenotype correlation

Analisamos as características clínicas e moleculares de 205 pacientes portadores das diferentes formas clínicas da deficiência da 21-hidroxilase, com diagnóstico hormonal e molecular definidos. As mutações mais freqüentes foram a I2 splice na forma perdedora de sal, a I172N na forma virilizante simples e a V281L na forma não clássica, com freqüências semelhantes às de outros estudos. Obtivemos baixa freqüência de deleção do gene da 21-hidroxilase, de forma semelhante ao identificado nas populações argentina e mexicana. Cinco mutações novas foram descritas em nossa população: G424S, H28+C, Ins 1003 1004 A, R408C e IVS2-2A>G. A severidade do genótipo também se correlacionou diretamente com níveis mais elevados de 17OH-progesterona e de testosterona. As mutações foram classificadas em três grupos, de acordo com o comprometimento da atividade enzimática observado in vitro: Grupo A: atividade de 0-2 por cento; Grupo B: atividade de 3-7 por cento e Grupo C: atividade >20 por cento. Houve forte correlação do grupo A com a forma perdedora de sal, do grupo B com a forma virilizante simples e do grupo C com a forma não clássica. A mutação I2 splice (Grupo A) em homo ou hemizigose conferiu o fenótipo de forma clássica, embora tanto a forma perdedora de sal quanto a forma virilizante simples tenham sido identificadas. A boa correlação do genótipo com o fenótipo na HAC-21OH permite sua aplicação na prática clínica, para o aconselhamento genético, diagnóstico e tratamento pré-natal das gestações de risco para a forma clássica da HAC-21OH e para confirmação diagnóstica após screening neonatal da HAC-21OH, exceto na presença da mutação I2splice.

Use of nonradioactive labeling to detect large gene rearrangements in 21-hydroxylase deficiency

OBJETIVO: Padronizar a técnica de Southern blotting usando hibridização com material não radioativo para detectar grandes rearranjos no gene CYP21A2 em uma amostra da população brasileira com hiperplasia adrenal congênita. MÉTODO: Foram estudados 42 pacientes, 2 dos quais aparentados, totalizando 80 alelos não relacionados. As amostras de DNA foram obtidas de sangue periférico, digeridas com enzima de restrição Taq I, realizado Southern blotting e hibridizadas com sonda marcada com biotina. RESULTADOS: O método se mostrou eficaz, com resultados similares aos encontrados ao utilizar a metodologia com material radioativo. Foram encontradas 2,5% de deleção do CYP21A2, 8,8% de grandes conversões, 3,8% de deleção do CYP21A1P e 6,3% de duplicação do CYP21A1P. Estas freqüências foram similares às encontradas em nosso estudo prévio, onde um número significante de casos foi estudado. Um bom padrão de hibridização foi alcançado utilizando menor quantidade de DNA (5mg) e a emissão de sinais foi observada entre 5 minutos e 1 hora de exposição. CONCLUSÕES: Padronizamos uma técnica de Southern blotting/ hibridização com material não radioativo (biotina) para a pesquisa de grandes rearranjos no gene CYP21A2 com bons resultados. Apesar de ser mais trabalhoso, este método é mais rápido, utiliza menores quantidades de DNA e, principalmente, evita problemas com o uso de radioatividade.

Post-mortem forensic identity testing: application of PCR to the identification of fire victim

CONTEXT: DNA analysis has been used with success in the identification of carbonized corpses and victims of large accidents. The analysis requires relatives of crash victims to donate blood for analysis. The relatives are generally willing contribute to the identification by giving a blood sample. OBJECTIVE: To describe the use of the polymerase chain reaction (PCR) for genetic characterization of one victim extensively burned by fire. DESIGN: Case report. CASE REPORT: DNA was extracted from blood of the cardiac chamber, and 15 different loci (D1S80, ApoB, D17S30, D3S1744, D18S849, D12S1090, FGA, D7S820, D1S533, D9S304, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTHO1, amelogenin and HLA-DQA1) were analyzed using the PCR technique. Results from all loci typing of the corpse were then compared to that of his alleged biological parents, revealing a genetic compatibility.

Protocol for rapid fetal sex determination in chorionic villus through polimerase chain reaction

A determinaçäo do sexo fetal e essencial para o diagnóstico pré-natal de doenças relacionadas ao sexo como hiperplasia adrenal congenita e sindrome de insensibilidade androgenica. As tecnicas de biologia molecular identificam a presença do cromossomo Y através de metodologia mais fácil e rapida do que a técnica citogenetica convencional. Utilizamos DNA extraido de vilo corionico de oito biopsias realizadas entre a 10 e 12 semanas de gestaçäo, para amplificar um fragmento de 778 pb correspondente a sequencia do gene SRY ("primers" XES10-XES11) na determinaçäo do sexo fetal. Como controle interno da reaçäo amplificamos simultaneamente um fragmento de 650 pb do exon 6-8 do gene CYP21B, gene ativo da 21 hidroxilase ("primers" 5' GAGGGATCACATCGTCGTGGAGATG3' e 5'TTCGTGGTCTAGCTCCTCCTG3'). O protocolo utilizado na PCR foi 94 graus C - 2 min; 32 ciclos: 94 graus C - 1 min, 63 graus C - 1 min, 72 graus C- 2 min e um ciclo de extensäo de 72 graus C - 10 min. Para confirmaçäo dos resultados da PCR realizou-se cariotipo a partir de cultura de células obtidas atraves de biopsia de vilosidade corionica. Em um caso o material näo foi suficiente para a realizaçäo do cariotipo. Este protocolo foi testado em 200 amostras de DNA extraido de leucocitos de homens e mulheres normais. A amplificaçäo do gene CYP21B ocorreu em todas as amostras enquanto a amplificaçäo do gene SRY apenas nas amostras dos homens. Das oito amostras de DNA extraidas de vilo corionico o gene SRY foi positivo em tres fetos masculinos e negativo nos cinco fetos femininos. O sexo fetal foi confirmado pelo cariotipo ou após o nascimento. Nos concluimos que este protocolo representa um método fácil, rapido e seguro de determinaçäo do sexo fetal